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Dec 07, 2023

バイオフィルムの推定

Biofilm e microbioma npj

npj Biofilms and Microbiomes volume 1、記事番号: 15014 (2015) この記事を引用

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17件の引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

バイオフィルム、特に尿素加水分解バイオフィルムは、医学界 (尿路感染症など)、科学者および技術者 (微生物による炭酸塩沈殿など) にとって興味深いものです。 これらのシステムを適切にモデル化するには、バイオフィルム固有の反応速度が必要です。 バイオフィルム特異的な反応速度を決定するための簡単な方法が記載されており、尿素加水分解バイオフィルムに適用されます。

バイオフィルムを小さなシリコンチューブ内で成長させ、流入および流出の尿素濃度を測定した。 サンプリング直後に、チューブの長さに沿ったバイオフィルムの厚さのプロファイルを推定するために、チューブを薄切しました。 尿素濃度とバイオフィルムの厚さのデータを使用して、尿素加水分解速度を推定するための逆モデルを構築しました。

大腸菌 MJK2 バイオフィルムにおける尿素加水分解は、尿素濃度 0.003 ～ 0.221 mol/l (0.186 ～ 13.3 g/l) の間の一次反応速度論によってよく近似されることがわかりました。 一次速度係数 (k1) は 23.2±6.2 h−1 と推定されました。 また、実験系では拡散よりも移流が支配的であり、バイオフィルム内の尿素加水分解は拡散輸送によって制限されないことも判明した。 この研究で議論されている特定の尿素加水分解バイオフィルムを超えて、この方法はバイオフィルム固有の速度を決定する必要がある場合に広く応用できる可能性があります。

微生物による尿素の加水分解は、その場でアルカリ性を生成し、その後炭酸塩鉱物を沈殿させる効果的な方法として広く知られています。 周囲中性 pH では、尿素 (CO(NH2)2) の加水分解は次のように記述できます。

ここで、加水分解される尿素分子ごとに 2 つのアンモニウム イオンと 1 つの重炭酸イオンが形成されます。 さらに、プロトンが 1 つ消費され、pH が上昇します。 カルシウムまたは他の二価陽イオンが存在する場合、炭酸塩 (CO32-) 濃度の増加により炭酸塩鉱物が沈殿する可能性があります。

尿素分解微生物が腎臓や尿路結石、カテーテル付着物の形成に果たす役割があるため、微生物の尿素分解による炭酸塩ミネラルの形成は医学において重要です。 1,2 尿素分解によるミネラルの形成は、医療分野での工学的応用についても広く研究されています。微生物による尿素加水分解は、全窒素のかなりの部分が尿素に起因すると考えられる工業廃水処理環境や農業廃水処理環境でも注目されています。上記のように、特に体積に対する表面積の比が高い場合、尿素分解活性のかなりの部分がバイオフィルムに起因すると考えられます。

バイオフィルムを含むシステムにおけるシステムの挙動を予測する際の重大な障害は、定量的でシステム固有の反応性輸送特性が欠如していることです。 この研究は、尿素分解活性を持つ、または持つように刺激された系に存在すると考えられる反応性輸送環境を明らかにするために、モデルバイオフィルムシステムにおける尿素分解に特に焦点を当てています。 浮遊培養物における尿素分解は徹底的に研究されており、微生物 6-9 および固定化酵素を含む多孔質培地における体積平均尿素分解速度を定量化するための多くの研究が行われています。 10,11 最も適用可能な研究は、これらの系における沈殿速度に焦点を当てています。バイオフィルムにおける尿素分解のミクロスケールの反応性輸送特性はほとんど議論されていない。

体積平均アプローチを採用するのではなく、土壌の細孔や尿路で遭遇する層流環境を模倣したシリコンチューブ内で尿素分解性バイオフィルムを成長させました。 鉱物の沈殿を引き起こすカルシウムやその他のカチオンはシステムに供給されなかったので、沈殿が起こったときに生じる複雑な問題を引き起こすことなく尿素加水分解を詳細に研究できました。 沈殿は尿素加水分解反応速度に影響を与える可能性がありますが、この研究では調査されませんでした。 シリコンチューブは破壊的にサンプリングされ、薄片化され、チューブの長さ全体にわたる正確なバイオフィルムの厚さのプロファイルが得られました。 バイオフィルムの厚さのプロファイルを流入および流出の尿素測定と組み合わせて、バイオフィルム体積あたりの尿素分解速度（ここではバイオフィルム固有速度と呼ぶ）を取得しました。 この論文は、バイオフィルム内の有効反応速度を測定する方法と、無次元化技術の適用を通じてバイオフィルム触媒による尿素加水分解の反応性輸送環境についてのより深い洞察を提供する。

大腸菌 MJK2 (参考文献 12) バイオフィルムは、流入尿素濃度が 0.011 ～ 0.221 mol/l (0.63 ～ 13.3 g/l) の範囲で、長さ 10 cm、サイズ 14 のシリコンチューブ (Masterflex、Cole-Parmer、IL、USA) 内で増殖しました。 ）室温（約20℃）で。 大腸菌 MJK2 は、大腸菌 DH5α(pURE14.8) 由来のウレアーゼ オペロンを含むように改変された pJN105 プラスミドを保有しており、また変異染色体 gfp (緑色蛍光タンパク質遺伝子) も保有しています 13,14。 実験は注射によって開始されました。接種材料をオートクレーブ処理したリアクターアセンブリに注入し、細胞を1時間付着させます。 菌株の詳細と接種材料の調製については、補足オンライン資料を参照してください。 次に、KDS220 マルチチャンネルシリンジポンプ (KD Scientific、米国マサチューセッツ州ホリストン) を使用して、1.0 ml/h (清潔なチューブ内のレイノルズ数 (Re) 0.1) で流れを開始し、1.0 ml/分で 10 日間維持しました。 流れは、滅菌培地で満たされた滅菌 60 ml プラスチック注射器を交換するために短期間のみ停止されました。 シリコン チューブは、内径が小さい (0.127 mm) PEEK チューブを介してシリンジに接続されました (図 1 を参照)。 小さな内径のチューブは、滞留時間を最小限に抑え、流入チューブ内でバイオフィルムの成長を助長しない高せん断環境を引き起こすことを目的としています。 バイオフィルムの成長がなければ、平均水力滞留時間は流入管内で 4.5 秒、シリコンチューブ反応器内で 12.1 分です。

管状反応器アセンブリの概略図。 滅菌 LB 培地を、壁にバイオフィルムが成長している長さ 10 cm、内径 (ID) 1.6 mm のシリコン チューブにポンプで送ります。 小さな内径の流入チューブを使用してシリンジをチューブリアクターに接続しました。 三方弁を使用して流入液サンプルを採取し、管型反応器の下流端を取り外して流出液サンプルを採取した。

10 日間のバイオフィルム成長後、3 つの連続した流出水サンプルと 1 つの流入水サンプルを採取しました。 定常状態の挙動を実証するために、3 つの連続した流出サンプルが採取されました。 少なくとも 1 つの連続した流出尿素濃度が 3 つのサンプルの平均から 25% 逸脱したチューブは、さらなる分析には使用されませんでした。 連続複製間の大きな変動は、サンプリング中のバイオフィルム剥離イベントなどの一時的な挙動を示しており、データセットがモデリングに適さなくなっています。 各チューブから採取された最後の流出サンプルは、薄切片サンプルが準備されたときに実験の終了に最も近い時点で採取されたため、代表的なものとして採取され、後続のすべてのモデルで使用されました。

チューブの下流端を取り外し、培地を実験流量で 1 時間 1.5 ml 微量遠心分離チューブに流すことによって、流出サンプルを採取しました。 図 1 に示すように、三方バルブによってサンプル チューブに流れを導くことにより、流入サンプルを最後に採取しました。空の微量遠心管の重量を量り、100 μl の 3.8% HCl を加え、重量を量り、サンプルを加え、再度重量を量りました。 ウレアーゼ酵素は低い pH.15 で活性を失うことが示されているため、最終サンプル pH 約 1.5 は尿素分解を停止するのに効果的です。最後に、サンプルを孔径 0.2 μm の酢酸セルロース シリンジ フィルター (VWR、ランドー、ペンシルバニア州、米国) に保管し、後で HPLC で尿素濃度を測定するために冷蔵しました。 液体サンプルを採取した直後に、セクション「バイオフィルムの厚さの測定」に記載されているように、薄切片によるバイオフィルムの厚さプロファイルを決定するために、シリコンチューブを破壊的にサンプリングした。

液体サンプリングの直後に、チューブを解剖して、各チューブの長さに沿ったバイオフィルムの厚さのプロファイルを測定しました。 各 10 cm チューブを 5 つの長さ 2 cm のセクションに切断しました。 各切片の中央１ｃｍを切り出し、外科用メスで縦半分に切断した。 残りの液体をティッシュペーパーで注意深く吸い取り、その後、Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek Inc.、米国カリフォルニア州トーランス、米国) の断面に分注し、ドライアイス上に置いて凍結させました。 OCT が完全に凍結したら、チューブの断面を剥がして、OCT に埋め込まれたバイオフィルムを残しました。顕微鏡検査により、チューブ上に重大なバイオフィルムが残っていないことがわかりました。 次に、凍結して埋め込まれたバイオフィルムを組織凍結固定型内の OCT に完全に埋め込みました。 凍結サンプルは、その後の薄切片作成のために -20 °C で保存されました。

凍結したバイオフィルムサンプルを厚さ 5 μm の断面に切断し、Leica CM1850 クライオスタットに取り付けました。 切片を帯電顕微鏡スライド (Fisherbrand Superfrost Plus Stain、Fisher Scientific、ハンプトン、ニューハンプシャー州、米国) にマウントし、風乾しました。 チューブの各セグメントについて 5 つのセクションを採取しました。 細菌によって生成された緑色蛍光タンパク質は、落射蛍光顕微鏡によって画像化されました。 薄切片は、CoolSNAP MYO CCD カメラ (Photometrics、ツーソン、アリゾナ州、米国)、PhotoFluor LM-75 光源 (89 North Inc.、バーリントン、バーモント州、米国)、Nikon Plan Apo を備えた Nikon E-800 顕微鏡で画像化されました。 10X/0.45 DIC L ∞/0.17 WD 4.0 対物レンズおよび FITC フィルター キューブ (EX 480/30、DM 505 LP、EM 535/40)。 生の 16 ビット画像は 1,940 × 1,460 ピクセル、ピクセル サイズは 0.4499 μm でした。 すべての蛍光画像は 2 秒の露光時間で取得されました。

生の画像は、オープンソース ソフトウェア FIJI16 で自動三角形法を使用してしきい値処理されました。17 三角形法は、Otsu (1979) などの他の一般的に使用される方法よりも最も代表的な結果が得られることが証明されました。 閾値処理された画像を定量化して、平均バイオフィルム厚さ (Lf) を決定しました。 これは、画像に示されている管の断面の計算された円弧長 (0.923 mm、補足表 SI を参照) を、閾値処理された画像から得られたバイオフィルム断面の面積で割ることによって行われました。18 重大な欠陥を含む画像は分析から除外されました。 欠陥には、厚さ測定の不正確さの原因となる塵埃、気泡、幾何学的不規則性が含まれます。 使用可能なすべての複製からの平均厚さが表示されます（厚さの計算と生データについては補足表SIII〜SXを参照）。 サンプルに目に見えるバイオフィルムが含まれていない場合、画像は撮影されず、厚さはゼロとして記録されました。 図 2 は、典型的な薄切片とそれに対して実行された分析を示しています。

薄切片画像の代表例。 (a) 透過光画像はバイオフィルムの定性的表現を示します。 (b) 緑色蛍光タンパク質 (GFP) シグナルを示す蛍光画像が定量化に使用されます。 (c) GFP 蛍光画像はバイオフィルム (白) と背景 (黒) を区別するために閾値処理され、バイナリ画像を形成します。 バイオフィルム信号の面積を定量化し、計算された可視弧長 (0.923 mm) で割って、代表的な平均バイオフィルム厚さを計算します。

尿素は、オートサンプラー内誘導体化を備えた高圧液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用して分析されました。12,19

COMSOL Multiphysics バージョン 4.3a (COMSOL Inc.、米国マサチューセッツ州バーリントン) を使用して管型反応器をモデル化し、管型反応器の長さ全体にわたって測定された尿素消費量に速度論パラメーターを適合させました。 管型反応器は、二次元の回転軸対称幾何学形状としてモデル化されました。 ナビエ・ストークス方程式を解いて流れ場を求め、バイオフィルム領域には流体の流れがゼロであると仮定されました。 薄切片データを使用して、各チューブリアクターのバイオフィルムプロファイルを再構築しました。 バイオフィルムの厚さは x の離散値に対して一定であると仮定され (モデル座標については図 3 を参照)、厚さは測定点間で線形補間されました。 バイオフィルムの厚さは、実験システムからシリコンチューブを除去したことによる潜在的なアーチファクトのため、リアクターの流入液または流出液（x=0および10cm）ですぐには測定できませんでした。そのため、x=0でのLfが仮定されました。 cmはx=1cmのLfに等しく、x=10cmのLfはx=9cmのLfに等しい。 尿素輸送は、ナビエ・ストークス流場による移流とフィック拡散を用いて計算されました。 バイオフィルムドメインにおける拡散輸送の減少は考慮されなかったため、拡散特性はシミュレーション全体を通じて一定であると仮定されました。 予備分析では、参考文献にあるように、バイオフィルム内の溶質の物質輸送抵抗の増加を実装することが示されました。 ２０は、レートフィッティングに最小限の影響を与えた（最も厚いバイオフィルムにおける差は１％未満、データは示されていない）。 境界条件とモデリングの仮定を図 3 に示します。

境界条件を含む COMSOL モデルの概要。

尿素加水分解反応速度 R は、各チューブ内のバイオフィルム全体内で一定で (濃度とは無関係)、バイオフィルム ドメインに限定されている (液相では反応しない) と仮定されました。 一定の反応速度の仮定の正当化については、「反応性輸送の特性評価」セクションで説明します。 流入および流出の尿素濃度は既知であるため、実験的に決定された濃度がモデルに適合するように尿素加水分解速度が適合されました。 出口境界における尿素濃度は空間内で (つまり、出口の断面全体で) 一定ではありません。 したがって、モデル濃度と実験濃度の差を直接最小化するのではなく、チューブ断面全体で平均した尿素のモデル流束と実験濃度の差が最小限に抑えられました。 3 つの流出尿素濃度のうちの最後の濃度は、破壊的サンプリングの時点に最も近い値で測定されたため、チューブの断面全体の代表的な平均濃度とみなされました。 既知の流出尿素フラックス JEF は、流出濃度 CEF に体積流量 Q を乗算して次のように計算できます。

CEF は平均的でよく混合された値です。 モデル化された総流出物尿素フラックス J'EF は、次のように流出物の液相の面積を積分することによって計算されました。

ここで、u は流体速度の x 成分、C は局所尿素濃度、ID はチューブ内径 (1.6 mm) です。 このモデルは、JEF と J'EF の間の二乗誤差の合計が最小化されるようにバイオフィルムの尿素分解速度を変化させて反復実行されました。 COMSOL 最適化モジュールを使用して、無次元フィッティング許容差 10-6 のネルダー・ミード法 21,22 を使用して、二乗誤差 (JEF-J'EF)2 を最小化する尿素加水分解速度 R を求めました。

各チューブの適合速度値は、尿素濃度の範囲での反応速度を表すデータセットにまとめられました。 バイオフィルム容積内の平均尿素濃度 CUrea,BF を各チューブについて計算し、当てはめた速度に対応する代表的な尿素濃度とした。 ミカエリス – メンテン (M – M) レート、Rm – m の関係は、MATLAB R2012a (The MathWorks, Inc.、米国マサチューセッツ州ナティック) の最小二乗曲線近似ツール (cftool) を使用して、コンパイルされたデータに近似されました。

Rmax は最大尿素分解速度、km は半飽和係数です。 M-M 関係がデータに最もよく適合するが、他のレート関係も比較に適合すると理論化されました。 次数 n の反応の場合、尿素濃度に関する一般化速度則は次のように書くことができます。

1 次 (n=1、線形) および 0 次 (n=0、一定速度) の関係は、微生物の尿素分解を説明するために以前に使用されている 7,12,23,24 ため、それらも回帰分析に含まれていました。

10 日間の運転後、すべての管型反応器で測定可能な尿素加水分解が観察されました。 流入尿素濃度は 0.011 ～ 0.221 mol/l の間で変化しました。 流出液濃度は、すべての連続複製を含めて 0.003 ～ 0.208 mol/l の間で変化しました。 チューブ 5、10、および 11 は、定常状態条件が満たされなかったため (平均からの偏差が 25% 以上)、分析から除外されました。 すべての尿素測定については、補足表 SII を参照してください。

バイオフィルムプロファイルは、11 のチューブリアクターの運転から首尾よく得られました。 バイオフィルムの厚さは 0.6 ～ 222.0 μm の範囲であり、すべての観察の平均は 18.7 μm でした。 バイオフィルムを通る流れがゼロであると仮定すると、すべての管型反応器で層流が予想される（観察された最も厚いバイオフィルムを有する反応器について最大Ｒｅ＝０．１８が計算された）。

各プロファイル ポイントについて、5 つの反復バイオフィルム厚さ測定値が収集されました。 測定値の 5.5% は、切削媒体内の気泡、粉塵粒子、変形部分などの明らかな不規則性のため、分析から除外されました。 提示されたすべてのバイオフィルムの厚さの測定値は、少なくとも二重に測定され、厚さ値ごとに平均 4.7 回の測定値が得られました。 生のバイオフィルム測定値は補足オンライン資料にあり、モデルで使用される平均プロファイルは図 4 にあります。

分析に使用される各管型反応器の反応輸送モデルによって予測される尿素濃度。 すべてのチューブの濃度マップは同じカラー スケールを使用してプロットされており、各チューブの尿素濃度範囲は異なるものの、各チューブ内では非常に狭い尿素濃度範囲であることが明らかです。 顕微鏡データから得られた各チューブのバイオフィルム プロファイルは、各パネルに白線で示されています。 チューブの中心から半径方向外側に向かって非常にわずかな濃度勾配があることに注目してください。

管型反応器の実験に関連する、対処しなければならないエラーの明確な原因がいくつかあります。 最も重大な誤差の原因は、バイオフィルムの厚さプロファイルの定義にあると予想されます。 チューブ全体のバイオフィルムの厚さが十分に特徴づけられていない場合、速度フィッティングは暗黙的に存在するバイオフィルムの量に依存するため、計算された速度は正確ではありません。 バイオフィルムの厚さプロファイルの推定には 5 つの潜在的な誤差原因があります: (i) チューブの流入および流出におけるバイオフィルムを正確に定量化できない、(ii) 測定点間のバイオフィルムの厚さが線形補間によって適切に近似できない可能性がある、 (iii) バイオフィルムの厚さはチューブの断面全体で一定ではない可能性があり、(iv) 水性分析のためのサンプリング中に重大な剥離事象が発生する可能性があります。

最初の 3 つの潜在的な誤差の原因では、問題はチューブ全体とそのチューブ内のバイオフィルムを 3 次元で合理的に画像化できないことです。 これらのエラーは、高い空間解像度でサンプリングする能力の欠如に直接関係しており、ランダム エラーと見なすことができます。 このシステムにおけるランダム誤差は、過小評価の場合と同じ確率で過大評価が発生することが予想されます。 言い換えれば、サンプリング方式では、バイオフィルムの厚い領域も薄い領域も見逃す可能性が同じくらいあります。 より高度な技術が必要になりますが、空間解像度が低いという問題は解決できます。 X 線マイクロトモグラフィー 25-27 や核磁気共鳴イメージング 28,29 などの 3 次元イメージング技術は、単純なバイオフィルム系をイメージングし、バイオフィルムの形状を効果的な反応速度の推定とより適切に結び付ける可能性を秘めています。

サンプリングプロセス中の分離イベントに関連するエラーはここでは定量化できませんが、エラーの兆候とその影響はわかっています。 水性サンプリング中、またはサンプリングと薄切片作成の間に大規模な剥離イベントが発生した場合、水性サンプリング中のバイオフィルムのプロファイルは不明ですが、薄切片で示されるバイオフィルムよりも厚いはずです。 これは、バイオフィルム量の過小評価により、その特定のチューブ内での有効反応速度の過大評価に常につながります。 他の種類のランダム エラーと同様に、この問題は、より高度な 3 次元イメージング技術を使用することで最小限に抑えることができます。 これらのより高度な技術は、バイオフィルムを乱さないように注意して利用する必要があります。

バイオフィルムの厚さの推定とは関係のない、別の潜在的な誤差の原因があります。 これは、バイオフィルムが均一であるという仮定に関連しています。 細胞密度、酵素生成 (この場合はウレアーゼ)、または一般的な代謝活性に違いがあり、速度定数を推定する際に不正確さの原因となる可能性があります。 この可能性はこの研究では直接調査されていませんが、その影響は排除できず、今後の研究の焦点となるはずです。 電子供与体または受容体が制限されている系は、そのような将来の研究にとって特に興味深いものとなるでしょう。

ダムケラー数 (Da) は、対流輸送の時間スケールを制御ボリューム内の反応の時間スケールで割ったものとして定義されます。 30 一次反応の場合、ダムケラー数は次のように定義できます。

ここで、τ は平均流体保持時間です。 Da のこの標準的な発現には、バイオフィルム相でのみ発生すると定義された速度を使用してシステムを変更する必要があります。 式 (6) は、τ が計算される全体積 (液体の体積) 内で反応が起こっていると仮定しています。 この場合、反応は液体の体積では発生していないため、輸送速度と反応速度は、それらが発生する体積に対して正規化する必要があります。

同様に、ペクレ数 (Pe) は、溶質の移流速度と同じ溶質の拡散速度の比として定義できます 31。ペクレ数は次のように表すことができます。

ここで、D は拡散係数で、25 °C の純水中の尿素の場合 1.38×10−9 m2/s (参考文献 31)、v は平均流速、L は代表的な長さスケールです。 v と L の値は、システムでの特徴付けに基づいて選択できます。 この場合、軸方向と半径方向の両方の挙動が重要となるため、2 つのペクレ数が定義されます。 最初の Pex は、速度が速度の x 成分の平均の大きさ vx であるとみなされる軸方向の挙動を特徴付けます。 2 番目の Per は、速度が速度 vr の r 成分の平均の大きさであるとみなされる半径方向の動作を特徴付けます。 長さのスケールは、半径方向の動作と軸方向の動作で異なります。 チューブの長さ ltube は軸方向の流れの長さのスケールであり、チューブ直径 dtube は半径方向の流れの長さのスケールです。

そして

考慮される最後の無次元パラメーターは、反応の時間スケールと拡散の時間スケールの比であるティーレ係数 (ϕ) です。 ティーレ係数は、一次反応の計算が簡単です。31

ここでの長さスケール (L) はバイオフィルムの厚さ (Lf) です。これは、この場合、ティーレ係数がこの系におけるバイオフィルムの潜在的な拡散制限を定量化する指標として計算されるためです。 これらのシステムではバイオフィルムの厚さが一定ではないため、各チューブの平均の高い値と低い値が全体の動作を制限するために使用されます。 表 1 は、研究の各管型反応器について計算された無次元パラメーター (平均、最小、および最大) を示しています。 無次元パラメータの計算に使用される値は、「運動パラメータのフィッティング」セクションで説明されている有限要素モデルから取得されました。

一般に、無次元パラメーター分析は、（拡散輸送や尿素加水分解ではなく）移流がシステムを支配しており、バイオフィルムが拡散制限されていないことを示しています。 ダムケーラー数は、この特定のシステムでは、移流輸送の時間スケールが反応の時間スケールよりも大きいことを示しています。 軸ペクレ数はすべて 1 よりはるかに大きく (Pex ≫ 1)、システムが強く移流支配されていることを示しています。 尿素の軸方向輸送のうち拡散に寄与できるのはほんの一部だけです。 半径方向のペクレ数は、移流と拡散の尿素輸送がよりバランスが取れており、拡散と移流の輸送が半径方向でより均等に寄与していることを示しています。

拡散係数が一定であると仮定して Per を制御する主な特性が 2 つあります。 まず、バルク流量が Per に影響します。 システム全体の流量が高くなると、半径方向の速度を含む全体の速度が大きくなります。 第二に、バイオフィルムプロファイルの不均一性は動径速度に直接影響します。 バイオフィルムのプロファイルがより一定になると (つまり、x のすべての値で等しい Lf に最も近くなります)、平均半径速度は減少し、したがって Per が減少します。 また、流速とバイオフィルムの厚さの不均一性が関連している可能性があることも予想されます。 この生理学的関係はここでは研究されていませんが、バイオフィルムがせん断環境と溶質輸送環境に適応することが示されています 32,33 大腸菌バイオフィルムは、その構造を特定の流体力学条件と栄養条件に適応させることが示されています。 具体的には、栄養素が過剰に提供されると（この研究では高い Da 値と低い ϕ 値により予想されるように）、大腸菌バイオフィルムはせん断応力に抵抗するように適応することが示されています 34。

ティーレ係数は系内で最も変化しやすい無次元パラメーターですが、すべての値が 1 未満であることが判明し、拡散の時間スケールが一般に反応の時間スケールよりも短いことを示しています。 これは、この研究におけるバイオフィルム内の尿素加水分解が強い拡散制限を受けないことを意味します。 言い換えれば、バルク液体濃度はバイオフィルム内で見られる濃度とほぼ等しいと予想されます（つまり、尿素濃度に急勾配はありません）。 この発見は、各チューブ内の反応速度および対応するバイオフィルム尿素濃度 (CUrea、BF) が一定であると仮定した場合の速度定数を決定する際に採用されたアプローチの重要な検証です。 小さなティーレ係数挙動の視覚的証拠は、図 4 にも見られます。ここでは、尿素濃度がバルク流体と比較してバイオフィルム内で大きく変化しているようには見えません。

定常状態の基準を満たす管型反応器は、個々の有限要素モデルを使用してモデル化され、モデル化された尿素フラックスと実験的尿素フラックスの差が最小になるまで尿素加水分解速度 R が変化しました。 計算された反応速度に対応する代表的な濃度は、各チューブのバイオフィルム容積内の平均尿素濃度であると仮定されました。

有限要素モデルから得られたデータにより、ミカエリス・メンテン (M-M)、1 次および 0 次のレート モデルを考慮した回帰分析が可能になりました。 尿素加水分解反応速度と代表的な濃度のプロットと速度モデルの適合を図 5 に示します。M-M および一次モデルがデータに最もよく適合します (二乗平均平方根誤差は 1.01 および 0.97 mol/(l h)それぞれ）、一方、ゼロ次は他のものと比べて適合度が低かった（二乗平均平方根誤差 = 1.56 mol/(l h)）。 M-M モデルと 1 次モデルの適合は、この研究で考慮された濃度範囲にわたって 95% の信頼度で統計的に違いはありません。 M-M モデルの速度定数は km=0.55 mol/l および rmax=15.9 mol/(l h) と推定され、一次モデルの速度定数は k1=23.2±6.2 h−1 (±は 95% 信頼区間) ）。

バイオフィルム容積内の平均尿素濃度と推定尿素加水分解速度。 モデル化された点は、バイオフィルム体積の平均尿素濃度 CUrea,BF に対する有限要素モデルによって計算された比率に対応します。 エラーバーは、有限要素モデルによって推定されたバイオフィルム容積内の尿素濃度の範囲を表します。 点には、それらを取得したチューブリアクターの番号がラベル付けされています (たとえば、図 4 を参照)。

一次挙動の実証は、より複雑なシステムをモデル化するために重要であり、この研究における重要な発見です。 他の研究者は、尿素分解による石化を含む尿素分解システムに一次反応速度論を使用しましたが、7,23、そのモデルの適用性は、これまでどのバイオフィルムシステムにも実証されていませんでした。 尿素加水分解で示されているように、M-M 反応速度論に従う反応の場合 11,15,35 は、通常、一次反応速度論は反応基質が低濃度 (C ≪ km) である系にのみ適用されるべきであると想定されています。 ここに示された結果は、純粋な酵素または浮遊生物の生物学的実験から得られた公表された速度論的値が、付着細胞およびバイオフィルムが主な触媒であるシステムでの使用には適切ではない可能性があることを示しています。 拡散制限はバイオフィルムの異なる速度論的挙動の理由として日常的に引用されていますが、この研究の結果は、重大な拡散物質輸送制限の証拠がなくても速度論的差異が発生する可能性があることを示唆しています。

この分析では、尿素の物質輸送制限が他の溶質とは独立して考慮されました。 例として、自然界のバイオフィルムは少なくとも部分的に酸素が制限されていることが多いため、酸素制限も調査できます。 この研究では、使用されるシリコンチューブのガス透過性が高いため、酸素が制限されるとは予想されていませんが、自然界では酸素が枯渇する可能性があり、尿素加水分解の反応速度に影響を与える可能性があります。 その結果、この研究で概説したアプローチを適用する場合、他のシステムでは他の溶質の質量輸送制限を考慮する必要がある可能性があります。

紹介された研究には直接的および間接的な応用があります。 この研究の最も直接的な応用は、大腸菌 MJK2 を使用した実験室研究の継続です。 この研究で得られたバイオフィルム固有の速度論パラメータは、より複雑なシステムにおける共焦点顕微鏡、フローセル、有限要素モデリングなどのツールと併用して、尿素分解性バイオフィルム内の局所的な化学勾配をさらに調査することができます。 特に適しているシステムには、尿管カテーテル 1 や尿素加水分解による微生物炭酸塩沈殿などがあります。3,4

特に尿素加水分解システムを超えて、この論文は流動システムにおけるバイオフィルムの有効反応速度を系統的に特徴付けるための堅牢な方法を紹介します。 小規模なチューブ リアクター方法には、CDC リアクター 36、アニュラー リアクター 37、ドリップフロー リアクター 38 などの、より一般的な実験室ベンチスケール バイオフィルム リアクターに比べて利点があります。主な利点は、コストと廃棄物の削減に関連しています。 シンプルなチューブリアクターには、一定のゆっくりとした流れを提供するシリンジポンプまたは同様のポンプ以外の特別な装置は必要ありません。 流量やチューブのサイズを変更することで、せん断環境を研究の特定の要件に合わせて簡単に調整することもできます。 チューブリアクター法は、危険物質が使用される研究にも適しています。 バイオフィルムによる有害物質の分解の定量化に焦点を当てた研究は、有害な廃棄物（塩素化芳香族化合物、炭化水素、ニトロ芳香族化合物、医薬品など）の生成を最小限に抑える実験を設計できるため、小型管反応器の研究に利用できる可能性があります。 高価な基質 (安定同位体化合物など) が使用される研究でも、チューブ リアクター システムで使用できる可能性があります。 チューブリアクター法には、大容量のアプローチと比較して欠点もあります。 研究によっては、複数の分析に大量のサンプルが必要な場合があり、そのような低流量システムの使用は非実用的です。

この研究で分析された特定のシステムは拡散制限がなく、各チューブの濃度範囲が狭いことが判明しました。 この場合、バイオフィルムリアクター内の有効体積反応速度を決定するために、はるかに単純な計算を実行できたはずです。 バイオフィルム全体の濃度が一定であるとみなせる場合、各チューブ内のバイオフィルムの平均反応速度は、バイオフィルムの体積を単純に計算し、それをチューブ全体の濃度の差で割ることによって決定できます。 すべてのシステムに対して一定の濃度を仮定することはできないため、ここではより厳密な逆モデリング アプローチが示されています。 一般に、拡散係数が低い大きな分子が速度論的解析の対象である場合、またはより厚いバイオフィルムが存在する場合には、さらに厳密な方法が必要となります。

バイオフィルム特異的な反応速度の決定は、バイオフィルム系の正確なマイクロスケールモデリングにとって重要です。 この研究では、チューブリアクターシステムでバイオフィルム固有の尿素加水分解速度係数を決定しました（ミカエリス・メンテンおよび一次速度モデルの両方）。 この研究で存在する化学条件および流体力学条件では、一次 (線形) 速度モデルが反応速度対濃度データに適合するだけでなく、計算で扱うのがより難しいミカエリス・メンテン モデルも適合することがわかりました。 プランクトン培養における大腸菌 MJK2 の以前の特性評価と合わせたこの研究により、この生物はバイオフィルムにおける尿素分解のさまざまな側面を研究するための貴重なツールになります。 アプリケーションには、医療、環境科学、工学の研究トピックが含まれます。 尿素分解に関連する特定の発見を超えて、この研究で提示された方法は、バイオフィルム固有の反応速度を決定する必要がある他のバイオフィルムにも広く応用できます。

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著者らは、NSF 賞番号 DMS-0934696 を通じて米国科学財団から、また米国エネルギー省助成番号 DE-FG-02-09ER64758、DE-FE0004478、DE-FE0009599 および DE-FG02-13ER86571 から資金提供を受けました。 JMC は、モンタナ州立大学の地質生物学システムにおける NSF-IGERT フェローシップ (DGE-0654336) によっても支援されました。

モンタナ州立大学バイオフィルム工学センター（米国モンタナ州ボーズマン）

ジェームズ・M・コノリー、ベンジャミン・ジャクソン、アダム・P・ロスマン、ロビン・ガーラック

モンタナ州立大学化学生物工学部、米国モンタナ州ボーズマン

ジェームズ・M・コノリー、アダム・P・ロスマン、ロビン・ガーラック

モンタナ州立大学数理学部、米国モンタナ州ボーズマン

ベンジャミン・ジャクソン

テンプル大学数学学部、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、米国

アイザック・クラッパー

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JMCが原稿を書きました。 JMC と RG は実験デザインを開発しました。 JMCとAPRが実験を実施した。 JMC は逆モデルを開発し、BJ、IK、RG によって批判的に評価されました。 原稿は IK と RG によって編集され、著者全員が原稿をレビューして承認しました。

ロビン・ガーラックへの手紙。

著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを宣言します。

補足情報は、npj Biofilms and Microbiomes の Web サイト (http://www.nature.com/npjbiofilms) にある論文に付属しています。

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転載と許可

コノリー、J.、ジャクソン、B.、ロスマン、A. 他バイオフィルム特異的な反応速度の推定: バイオフィルムにおける細菌の尿素加水分解の動態。 npj バイオフィルム マイクロバイオーム 1、15014 (2015)。 https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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受信日: 2014 年 11 月 26 日

改訂日: 2015 年 4 月 26 日

受理日: 2015 年 7 月 4 日

公開日: 2015 年 9 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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