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Jan 14, 2024

ニッチな温泉専門店の高い種分化率

Rivista ISME (2023) Citazione

ISME Journal (2023)この記事を引用する

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

生態学的プロセスと進化的プロセスは微生物の多様性を同時に制御しますが、進化のプロセスとその原動力はほとんど解明されていないままです。 今回我々は、16S rRNA 遺伝子の配列を解析することにより、広い温度範囲（54.8 ～ 80 °C）にわたる温泉における微生物叢の生態学的および進化的特徴を調査しました。 私たちの結果は、ニッチなスペシャリストとニッチなジェネラリストが生態学的および進化的ダイナミクスの複雑な相互作用に組み込まれていることを実証しました。 熱耐性ニッチ軸では、熱 (T) 感受性 (特定の温度) と T 耐性 (少なくとも 5 つの温度) の種は、異なるニッチの幅、群集の存在量、分散の可能性によって特徴付けられ、その結果、潜在的な進化の軌跡が異なります。 ニッチに特化した T 感受性種は強い温度障壁を経験し、完全な種のシフトと各温度での適応度は高いが豊富なコミュニティ (「ホームニッチ」) が低くなり、高い種分化によって証明されるように、このようなトレードオフによりピークパフォーマンスが強化されました。温度の変化に応じて多様化の可能性が高まります。 対照的に、T耐性種はニッチ拡大には有利であるが、高い絶滅率を伴う広いニッチ幅で示されるように、局所的なパフォーマンスが悪く、これらのニッチジェネラリストが「何でも屋で無の達人」であることを示している。 このような違いにもかかわらず、T 感受性種と T 耐性種は進化的に相互作用しています。 具体的には、T 感受性種から T 耐性種への継続的な移行により、温度全体にわたって比較的一定のレベルで T 耐性種の排除確率が保証されました。 T 感受性種と T 耐性種の共進化と共適応は、レッドクイーン理論と一致していました。 まとめると、私たちの発見は、ニッチな専門家の高度な種分化が、環境フィルタリングによって引き起こされる多様性に対する悪影響を軽減できる可能性があることを示しています。

温度は、地熱生態系における微生物の多様性の重要な要因です[1、2、3]。 微生物の多様性が温度と相関していることは十分に確立されていますが[4、5、6]、温度が多様性を調節するメカニズムを理解する取り組みにより、2つの視点が得られました。 第一に、多様性は、主に耐熱性 (種が生育できる温度範囲) の種間の違い [7] に起因する、現存種の組成代謝回転に対する温度の影響による生態学的プロセスの結果であるが、種の相互作用の結果である[8]。 2 つ目では、多様性は進化の過程に由来し、主に種分化および/または絶滅率に対する温度の影響の結果として生じます [9、10]。 これらの生態学的プロセスと進化的プロセスは通常、同じ状況で同時に発生し、同時に寄与します [11、12] が、進化のプロセスは生態学的プロセスと比較してほとんど解明されていません [13、14]。

種分化は生物多様性の究極の推進力であり、種分化の速度に影響を与える要因と種の豊富さへのフィードバックを理解することは生態学における中心的な課題です。 周囲温度が種の豊富さにどのように関係するかについての具体的な予測は、マクロベに関する生態代謝理論 (MTE) の文脈で開発され [15、16]、その後微生物にも拡張されました [17、18]。 これらの以前の研究は主に 45 °C を超えない温度勾配に焦点を当てています。 最近の分析では、増殖速度の温度依存性を考慮すると、生態学の代謝理論は中温菌（最適温度 ≤ 45 °C）には当てはまるが、好熱菌（>45 °C）には当てはまらないことが文書化されており、中温菌の活性化エネルギー E = 0.65 eV が示唆されています。好熱菌の場合は E ≈ 0 eV [19]。 好熱性代謝が標準的な MTE 仮説から逸脱する可能性がある理由の 1 つは、温度に対してバイオマスが一定であると仮定していることですが、温泉内の微生物バイオマスも温度とともに指数関数的に減少するためです [20]。 好熱菌にとって、環境温度は進化速度の主な決定要因であり[21、22]、一部の研究では好熱菌の生成時間は温度に反比例することが報告されており[23]、これは高温で種分化速度が高くなることが予測される。 同時に、温度が高くなると、過酷な環境フィルタリングによって適応が不十分な微生物種が排除され[5、6]、最終的にはより高い絶滅率が示されます。 しかし、系統発生の観点から見た種分化と絶滅の速度の温度依存性に関する直接的な証拠はまだ示されていません。

地熱泉は微生物進化の孤立した島として機能し、その中の微生物相はより大きな拡散制限 [24] とより速い進化速度 [25] を経験します。 しかし、これらの好熱菌であっても、種が異なれば、温度などの局所的な条件に対して反対の反応を示す可能性があります。 ニッチの幅は重要な進化の推進力として機能し、種の多様化と適応の速度に影響を与える可能性がある[26、27]。 広い温度または狭い温度に適応した種は、生化学的および生理学的特性、および生態学的および進化的適応性の違いにより、異なる生存可能性を持っています[29、30、31、32]。 しかし、ニッチの幅（つまり、耐熱性）の違いが生態学的および進化の過程、ひいては種の多様性に影響を与えるかどうか、またどのように影響するかはほとんどわかっていません。

この研究では、16S rRNA 遺伝子のハイスループットシーケンスに基づいて、54.8 ～ 80 °C の広い温度範囲にわたる微生物叢の生態学的および進化のプロセスが特徴付けられました。 BiSSE (二値状態の種分化と絶滅) モデルを使用して、高温に対する微生物の適応における進化的特徴を特徴付けました。 我々は以下の質問をした: (i) ニッチの幅（特に温度ニッチ軸）が生態学的および進化的パフォーマンスにどのように影響するか？ (ii) ニッチな専門家とニッチなジェネラリストは、温度を超えて進化的にどのように相互作用したか? (iii) 極端な環境（つまり気温）の増加に直面して、群集レベルでの生態学的および進化的トレードオフは全体的な多様性パターンにどのような影響を与えるのでしょうか?

現地測定とサンプル収集は、2019年8月に中国雲南省騰衝市（北緯24度56分〜25度27分、東経98度26分〜98度27分）で実施されました（図S1）。 研究サイトは、以前に説明したレハイ地熱地帯 [2、6] に位置し、多数の泉と泥だまりがあり、激しい熱水活動に満ちていました。 Direchi (DRC) は、温度がベントの 80 °C からプールの 54.8 °C まで低下する流路に沿ってサンプルを収集するために選択されました。 堆積物の上にある水の深さはわずか 5 ～ 15 cm です。 現場の温度と pH は、ポータブル温度センサー (Hl9124、Hanna Instruments、イタリア) を堆積物のすぐ上の地表水に浸すことによって測定されました。 この流路は、カラフルな浮遊微生物マットによってさまざまな小規模エコリージョンに分割することができ、DRC1 (80 °C) から DRC8 (54.8 °C) とラベル付けされた 8 つの小規模エコリージョンから微生物および化学分析用の表面堆積物サンプルを収集しました。 °C）、それぞれにランダムに分散された7つの複製があります（図S1）。 これらのサンプルは滅菌スパチュラとスプーンで収集され、チューブに入れる前に滅菌済みのアルミニウムパンで均質化されました。 さらに、各サンプリング領域の亜硝酸塩 (NO2-)、硫酸塩 (SO42-)、硫化水素 (H2S)、第一鉄 (Fe2+)、全鉄 (Fetotal)、および溶存酸素 (DO) の濃度がその場で測定されました。 Hach テストキット (Hach Chemical Co.、アイオワ州、米国) を使用 (表 S1)。 全窒素 (TN)、硝酸塩 (NO3-)、および有機物 (OM) は、以前に公開されたプロトコル [33] に従って、風乾した堆積物で測定されました (表 S1)。 すべてのサンプルはドライアイス上で直ちに凍結され、さらなる分析まで研究室で -80 °C で保存されました。

MoBio Power Soil DNA 単離キット (MoBio Laboratories、米国カリフォルニア州カールズバッド) を製造元のプロトコールに従って使用して、0.25 g の沈殿物から核酸を抽出しました。 各サンプルは 3 回ずつ実行され、最終ステップで各サンプルの抽出された DNA が 1 つの収集チューブにプールされました。 全長 (FL) および V4 領域 16S rRNA 遺伝子配列を、プライマーセット 27F (5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3')/1492R (5'-RGYTACCTTGTTACGACTT-3') および 515F (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3) を使用して増幅しました。 ')/806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 両方の 5' 末端にそれぞれ固有のバーコード配列があります。 FL PCRシステムは、10.5μlのNFW、15μlのKOD ONE MM、1.5μlのフォワードプライマーおよびリバースプライマー（10μM）、および1.5μlのテンプレートDNA（5〜30ng）を含む30μlの混合物中で実施した。 V4領域の各50μl PCR増幅混合物には、5μlの10×PCRバッファー、1.5μlのdNTP混合物（それぞれ10mM）、1.5μlのフォワードおよびリバースプライマー（10μM）、0.5μlのTaq DNA酵素（TaKaRa）、2μlが含まれていました。 DNA、1 μl BSA、および 37 μl ddH2O。 PCR プログラムは次のとおりでした: 95 °C で 5 分間 (V4 領域では 3 分)、95 °C で 30 秒 (V4 では 15 秒)、55 °C で 30 秒 (V4 では 15 秒)、および 72 °C で 30 サイクル90 秒 (V4 の場合は 45 秒)、最終伸長は 72 °C で 7 分間 (V4 の場合は 5 分間)。 PCR 産物は 1.2% (V4 では 1.8%) アガロースゲルで検証され、Monarch DNA ゲル抽出キットで精製されました。 濃度は Qubit 蛍光光度計 (Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド) で定量され、その後等モル量の DNA が PacBio および HiSeq ライブラリ構築用にプールされ、Biomark Biotechnology Co. の PacBio RS II プラットフォーム [34] での配列決定のために送られました。 Ltd. (中国、北京) と Magigene Biotechnology Co., Ltd (中国、広州) の HiSeq プラットフォーム。

細菌の 16S rRNA のコピー数は、プローブ アプローチを使用したドロップレット デジタル PCR (ddPCR) によって定量化されました [35]。 プローブ用の 10 μl ddPCR スーパーミックス、1.8 μl フォワードプライマー 515 F (10 μM) (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')、1.8 μl リバースプライマー 926 R (10 μM) (5') で構成される 20 μl ddPCR 増幅混合物の 3 連-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3')、0.5 μl 細菌プローブ (10 μM) (5'FAM-ACTACNVGGGTWTCTAATCCBKTT-BHQ3')、2 μl のテンプレート DNA (5 ～ 30 ng)、および 3.9 μl ddH2O は、12,000 ～ 20,000 に変換されました。 QX200 液滴生成器 (Bio-Rad) を使用した液滴。 次に、各サンプルで生成された液滴を 96 ウェル プレートに移し、MyCycle サーモサイクラー (Bio-Rad) で次の条件を使用して増幅しました。95 °C で 10 分。 94 °C で 30 秒の変性、47 °C で 30 秒のアニーリング、72 °C で 1 分間の伸長を 40 サイクル。 そして最終伸長は 98 °C で 10 分間です。 続いて、プレートを QX200 液滴デジタル リーダー (Bio-Rad) にロードし、プレートの各ウェルから液滴を自動的に読み取ります。 データは、QuantaSoft ソフトウェア (Bio-Rad) を使用して分析され、使用されたさまざまな量のテンプレート DNA について補正されました。

ハイスループットシーケンシングによって生成されたショートリード（V4領域）は、社内のGalaxy Pipeline（http://mem.rcees.ac.cn:8080）を介して分析されました[36]（図1A）。 簡単に言うと、生のシーケンスは、エラーが許されない状態でバーコード識別によって逆多重化されました。 次に、プライマー配列がトリミングされ、FLASH [37] を使用してフォワードリードとリバースリードが結合され、続いて品質管理が行われました。 品質フィルタリング基準には、平均品質スコア >20、最小長 140 bp、およびあいまいな塩基がないことが含まれていました。 良質のリードは、Deblur [38] を使用してサブオペレーショナルタクソノミックユニット (sOTU、アンプリコン配列バリアント (ASV) に等しい) を生成するために使用されました (図 1A)。 生の PacBio FL 配列は、最初に JGI SMRT ポータルの「インサートの読み取り」プロトコルを使用して、Q20 に相当する 99% 以上の精度で正しい配列エラーを受けました。 次に、品質フィルタリング、キメラ検出、クラスタリングも前述の Galaxy Pipeline 経由で実行されました (図 1A)。 リード長分析に基づいて、≤1340 bp または ≥1640 bp のリードが削除されました [39]。

A 全長シーケンスおよび V4 領域シーケンスのためのデータ処理。 B 完全長 16S rRNA 遺伝子とその超可変 V4 領域をターゲットにするために使用されるプライマー セット。 C V4 シーケンスと全長シーケンスの間の OTU のオーバーラップ、および V4 シーケンスの sOTU を全長シーケンスの OTU にマッピングする。

現在、16S rRNA 遺伝子の FL リードの配列処理方法は、ショートリードの解析ほど成熟していません。 ロングリードのクラスタリングにはさまざまな方法が使用されており、ASV [40、41] に基づくものもあれば、99% [42] または 97% の類似性レベル [43] の OTU に基づくものもあります。 間違いなく、正確な ASV は単一ヌクレオチドの分解能を提供しており、16S rRNA 遺伝子参照データベースから独立しています [44]。 ただし、ASV メソッドの使用と開発は主にショート リードに基づいており、ロング リードに適用する場合は慎重に検討する必要があります。 大きな懸念は、PacBio CCS [45] に基づくロングリードシーケンスのかなりのエラー率と、ASV のクラスターフリー手法がこれらのシーケンスエラーの影響を間違いなく増幅することです。 私たちの研究では、多様性推定の人為的なインフレを制御しようとしたため、シーケンスエラーの影響を軽減するために類似したシーケンスを一緒にビン化する（つまり、UPARSE）必要があります[39、42、43]。 UPARSE [46] (図 1A) を使用して、99% と 97% の類似性レベルで 2 つのクラスタリングしきい値をテストしました。 結果は、99% と 97% のクラスタリング閾値が微生物の分類学的多様性と系統学的多様性に関して同様の傾向をもたらすことを示唆しました (ピアソン相関、R2 = 0.36 ～ 0.79、p < 0.001) が、99% の類似性レベルでは希少微生物の数をはるかに超えていました。種。 最終的に、97% の類似性レベルを選択してクラスタリングし、データを提示しました。

FL 配列と V4 配列の両方の代表配列の分類学的割り当ては、SILVA データベース 138.1 バージョン [48] に基づいた RDP (リボソーム データベース プロジェクト) 分類子 [47] を使用して実行されました。 FL 配列は細菌のみを捕捉したため、古細菌に割り当てられたこれらの V4 配列は破棄されました。 廃棄されたシーケンスは、V4 シーケンス全体の 5% 未満を占めました。

FL 配列と V4 配列の両方の代表的な配列は PyNAST [49] によってアラインメントされ、系統樹は FastTree [50] によって構築されました (図 1A)。 下流解析におけるシーケンスの深さの違いの影響を排除するために、12573 個の FL シーケンスと 42910 個の V4 シーケンスがランダムにリサンプリングされました。 正規化されたデータに対して希薄化曲線が構築されました (図 S2)。 分類学的アルファ多様性 (シンプソン指数と観察された豊富さ) は、温度グループごとに個別に計算されました。 微生物の系統的多様性に対する種の豊富さの影響を排除するために、種の豊富さとは独立した平均最近接分類群距離 (MNTD) および最近接分類群指数 (NTI) [51, 52] が決定されました。 これらは、「picante」R パッケージの「mntd」および「ses.mntd」を使用して、木の先端の系統発生的特徴を反映するように計算されました。 MNTD は、各 OTU をサンプル内の最も近い親類に接続する枝の長さの平均として計算され、NTI は、ソース プールからの 999 のランダムなリサンプリングを介して種の豊富さの影響を考慮した MNTD の標準化された効果サイズの -1 倍として計算されました。ヌルモデル[53]。 MNTD 値が小さいほど、チップ間の系統学的関連性が高いことを表し、NTI 値が高いほど、チップ間の系統学的クラスタリングがより多くなることを示します [51、54]。

種レベルで明確な注釈が付いた 1555 種の系統樹が構築され、iTOL パイプライン (https://itol.embl.de/) [55] を使用して視覚化されました。 各種は、最も豊富な OTU によって表されました。 枝と最も内側のリングの異なる色はさまざまな門を示し、最も外側のリングは耐熱性の幅の形質を表します。 棒グラフは、温度グループ全体の各 OTU の相対的な存在量を示しました。

Blomberg の K は、「picante」R パッケージの「multiPhylosignal」関数を使用して、潜在的形質としての分類群の環境選好に基づく系統発生シグナルを表すために計算されました [56]。

Levins のニッチ幅指数 [57] で表されるコミュニティレベルの平均ニッチ幅は、R の「spaa」パッケージ [58] を使用して決定されました。 ニッチの幅が大きいほど、微生物群集がより多くの資源を利用できることを示している可能性がある [59、60]。

コミュニティの分散能力を評価するために、中立コミュニティ モデル (NCM) を使用して、OTU の検出頻度と、より広範なメタコミュニティ全体にわたる OTU の相対的な存在量との関係を予測しました [61、62]。 NCM は、大規模な微生物集団に合わせて調整された中立理論を適応させたもので、通常、群集の集合における確率過程の重要性を定量化するために使用されます。 このモデルでは、Nm はコミュニティ間の分散の推定値です。 パラメータ R2 は、中立モデルへの全体的な適合を表します [61、62]。 NCM は、無料のオンライン データ分析 Web サイトである Tutools プラットフォーム (https://www.cloudtutu.com) で実行されました。

スピアマン相関を使用して、環境要因とα多様性指数の間の相関関係、および環境要因とさまざまな門の相対存在量の間の相関関係を調査しました。 有意な相関関係は、R の「ggcor」パッケージを使用して視覚化されました。類似性分析 (ANOSIM) [63]、多重応答順列手順 (MRPP) [63]、および順列多変量分散分析 (PERMANOVA) [64、65] が実行されました。温度グループ間での有意な差を特定します。 重み付けされていない UniFrac マトリックスに基づく PCoA を使用して、温度グループ間の微生物群集構造の変化を表示しました。 マンテル テストと CCA を使用して、微生物群集構造の変動に対する環境要因の影響を推定しました。 微生物群集構造（PCoA の最初の軸）に影響を与える環境要因の相対的重要性を評価するために使用されるランダム フォレスト モデルは、R の「randomForest」と「rfPermute」を使用して実行されました [66]。 我々は、主成分分析（PCA）によって環境要因の次元を削減することにより、温度とその他の環境要因の両方を一緒に考慮するための環境極限を提案しました。 スピアマン相関とランダムフォレスト分析を除き、すべての分析は Galaxy Pipeline (http://mem.rcees.ac.cn:8080) 経由で実行されました [36]。

私たちは、地熱生態系の狭い熱耐性幅に適応する種を表すために「T 感受性」と「T 耐性」を使用しました。 「T 感受性」種と「T 耐性」種を定義するグループ化基準は、観察された分布と 100,000 の順列から導出される予想される分布を比較することによって得られます。 私たちは、特定の温度での種の濃縮と、5 ～ 8 温度以下の種の濃縮（観測されていない種 > 期待されない種の場合）、つまり特定の温度で発生する種と少なくとも 5 つの温度を占める種がランダムに観察されたのではなく、次の要因によって引き起こされたことを発見しました。決定的な要因。 この理論的根拠に基づいて、特定の温度で見つかった種は T 感受性種として分類され、5 ～ 8 つの温度で見つかった種は T 耐性種として分類されました。 次に、2 つの進化状態としての T 耐性と T 感受性を二値状態の種分化と絶滅 (BiSSE) モデルに適用して、種分化、絶滅、および遷移率を計算しました [67]。

現存する生物群集の背後にある進化的出来事に関する最も豊富な情報源である化石記録は、細菌と古細菌についてはほとんど存在せず[68]、研究者は進化の再構築のために現存する配列データを使用する必要がある[69]。 BiSSE モデルにより、現存する微生物種の進化的特徴を研究することが可能になります。 BiSSE モデルは系統樹ベースのモデルであり、現存種の 2 状態 (バイナリ) 進化的特徴 (つまり、種分化、絶滅、状態遷移率) を計算できます [67]。 分析は「diversitree」R パッケージを使用して実行されました [70]。

BiSSE モデルには、より包括的な生命の系統樹が必要になります。 まず、SILVA データベースの全種生木 (LTP) に基づいて解析を行いました。 全種生木は SILVA データベースからダウンロードされ、同定された T 耐性種と T 感受性種は、BLASTN を使用してこの木にマッピングされました (同一性 ≥ 98%、長さ ≥ 1000、E 値 ≤ 1e − 5)。 合計で、T 感受性種については 3,241 の代表的な配列 (オリジナルから 26,070) が保存され、T 耐性種については 217 (オリジナルから 524) が保存されました。 SILVA データベースでは、多くの異なる OTU が同じ種と一致することがわかりました。 したがって、1063 のマッピングされた種を含むサブツリーが LTP ツリーから抽出され、線形化され、R の「ape」パッケージを使用してウルトラメトリック ツリーを再構築できるようになりました。さらに、特殊な地球化学的条件により、温泉には大量の「微生物」が繁殖します。ダークマター」 [71, 72]。 微生物叢が生息する地熱泉では進化速度が速く [25, 73]、その結果、新たな「微生物暗黒物質」が発生する可能性があります。 これらの「微生物の暗黒物質」は、比較的完全なデータベース (SILVA データベースなど) に含めることはできません。 したがって、地熱泉の代表的な配列を SILVA データベースと比較すると、All-Species Living Tree (LTP) でその近縁種を見つけることができる配列のサブセットのみが存在します。 したがって、温泉中の微生物の進化特性を決定するために、全種生木 (LTP) のサブツリーを参照して BISSE モデルを計算することは包括的ではありません。 そこで、独自の配列を使用して、FastTree によって統一系統樹を構築しました。 BiSSE モデル分析は、LTP サブツリーと自己構築された系統樹に基づいて実行されました。

入力線形化系統樹ごとに、diversitree が 2 回実行されました。最初に、starting.point.bisse 関数を使用してシミュレーションのヒューリスティック開始点を生成し、次に find.mle 関数を使用してレート パラメーターの最尤推定値を取得しました。 最初の推定ラウンドでは、T 耐性種と T 感受性種は同一の種分化率と絶滅率を持つように制約されました。 第 2 ラウンドは、すべての速度パラメーターを制約せずに実行され、T 耐性種と T 感受性種が異なる種分化と絶滅の速度を持つことが可能になりました。 最終推定の堅牢性を評価するために、分散分析 (ANOVA) 検定を使用して、制約付きの結果 (最初のラウンドから) が制約なしの結果 (2 回目のラウンドから) と大きく異なるかどうかを検証しました。

微生物の多様性に対する種分化と遷移速度のプラスの寄与と、絶滅率のマイナスの寄与を考慮して、次のように指数「多様化の可能性（DP）」を定義しました。

ここで、λ、μ、t はそれぞれ種分化速度、消滅速度、遷移速度を表し、BiSSE モデルから得られます。

環境フィルタリングの増加によって引き起こされるフィルタリングアウト効果を考慮すると、次の方程式に従って環境フィルタリングポテンシャル (EP) を表すために消滅率を使用します。

DP と EP は温度に関連しているため、生態代謝理論 (MTE) [6, 74] を使用して、温度軸に沿った DP、EP およびそれらの相対強度 (RSDP 対 EP) の変動を定量化しました。 方程式は次のとおりです。

ここで、K はボルツマン定数、T はケルビン (K) 単位の絶対温度です。 活性化エネルギー E は、線形回帰の傾きの逆数に等しくなります。

16S rRNA 遺伝子のハイスループットシーケンスは、微生物の進化と多様性に対する私たちの見方を根本的に変えてきました。 FL と断片化された 16S rRNA 遺伝子の組み合わせにより、断片化配列のみによる不十分な系統分類と、FL 配列のみによる低品質の制限が軽減される可能性があります。 FL および V4 の断片化された配列について、バリアント配列の深さが得られました。 高品質リードの数は、FL シーケンスではサンプルあたり 12,573 ～ 28,924 シーケンスの範囲でしたが、V4 シーケンスでは 42,910 ～ 243,816 シーケンスでした。 希薄化曲線は、V4シーケンスの場合はリサンプリング深さ42,910で多様性の大部分をカバーできるが、FLシーケンスの場合はリサンプリング深さ12,573で飽和に達しないことを示しました（図S2）。

V4 配列と FL 配列の間の一貫性を比較するために、BLASTN を使用してペアワイズ配列アラインメントを実行しました (図 1B)。 97% の同一性レベルでは、V4 配列の 82.51% が FL 配列内に見つかり、FL 配列の 83.96% が V4 配列と一致することができました。 さらに、V4配列の単一のsOTU（サブオペレーション分類単位、アンプリコン配列バリアント（ASV）に等しい）がFL配列の複数のOTUと一致する可能性があることを発見しました（図1C）。これは、FL配列がより包括的な分類学をカバーしていることを示しましたV4 配列よりも系統解析の解像度が高いプロファイルです。 したがって、その後の解析のほとんどは主に FL シーケンスに依存しました。 ただし、FL 配列は短い配列ほど深くないため (図 S2)、一部の分析は V4 断片化配列でも補正されました。

66 の門に属する合計 28,073 の OTU が FL 配列から同定され、11 の優勢な細菌門 (56 サンプルで平均相対存在量が 3% 以上) が再サンプリングされたサンプルの 53.0 ～ 95.9% の配列を占めました。 優勢な門の相対的な存在量は、温度グループ間で変動しました (図 2A)。 具体的には、プロテオバクテリア、バクテロイデス属、放線菌およびシアノバクテリアの相対存在量は、ファーミクテス属、アルマチモナドタ属、サーモトゴタ属、カルダトリバクテリオタ属およびニトロスピロタ属の相対存在量とは逆に、温度とともに有意に増加しました（p < 0.05）（図S3A）。 液滴デジタル PCR (ddPCR) によって定量化された微生物の絶対存在量は、温度とともに減少しました (図 S3B)。 主座標分析（PCoA）は、複数の非類似性試験（表S2）によって確認されたように、異なる温度グループの微生物群集構造が明確に分離されていることを示しました（図S3C）。 マンテル テストは、温度に加えて、温度とともに変化する pH、NO3-、NO2-、TN、OM などの他の変数も微生物群集構造と有意な (p = 0.001) 相関関係があることを示しました (図 2B)。 正準対応分析 (CCA) では、微生物群集構造の明確な温度依存の分布パターンがさらに表示されました (F = 1.751、p = 0.001) (図 2C)。 さらに、ランダムフォレストの環境変数の平均予測因子の重要性は、温度が微生物群集構造パターンを駆動するより重要な予測因子（より高いMSE％値）であることを示しました（図2D）。

門レベルでの微生物群集構成。56 サンプルで平均相対存在量が 3% を超える 11 の優勢な細菌門を含み、3% 未満のものは「その他」にまとめられました。 列の上の DRC8…DRC1 の ID は、8 つのサンプリング サイトを表します。 B、C それぞれ（部分的）マンテルテストと標準対応分析（CCA）に基づく、環境要因と群集構造の間の有意な相関。 D ランダム フォレストに基づく微生物群集構造に対する環境要因の相対的な寄与 (PCoA の第 1 軸)。 %IncMSE は、平均二乗誤差の増加を意味します。 値が大きいほど、環境要因の重要性が高くなります。 p 値、ns は有意でないことを示します。 * p < 0.05 の場合; ** p < 0.01 の場合。 *** p < 0.001。

サンプリング地点全体にわたる微生物の分類学的パターンと系統発生パターンを解読するために、我々は、シンプソンの多様性指数、種の豊富さ、平均最近接分類群距離（MNTD）および最近接分類群指数（NTI）を環境極値軸に沿って調べました。環境変数の複合効果（図S4）。 地熱泉は古代初期の地球に似ています。 私たちが知っているように、地球は寒冷化のプロセスを経験しており、環境温度が好熱菌の多様性の拡大を促進する最も顕著な要因となっています[21、22]。 したがって、微生物の多様性に対する温度の影響は特に興味深いものでした。 微生物の多様性に対する温度の影響（図3）は、環境変数の複合効果の影響（図S4）と一致していることがわかり、温度が微生物の多様性パターンの推進において支配的な役割を果たしていることが示されました。

A シャノン (n = 7)、B リッチネス (n = 7)、C 平均最近接分類群距離 (MNTD) (n = 7)、D 最近接分類群インデックス (NTI) (n = 7) の変動傾向気温。 ピアソン相関係数を図に示しました。 E ブロンベルグの K と温度によって推定された系統発生シグナルは、最も強い系統発生シグナルを示します。 F Levins の幅広い温度範囲。 文字は重要な違いを示します。

具体的には、シンプソンの多様性指数は、54.8 °C (DRC8) での 35.0 ± 16.1 から 80 °C (DRC1) での 23.4 ± 10.5 まで、温度とともに大幅に減少しました (R2 = 0.19、p < 0.001) (図 3A)。 同様のパターンが種の豊富さでも観察され（R2 = 0.24、p < 0.001）、54.8 °C での 996 ± 260 から 80 °C での 633 ± 150 に減少しました（図 3B）。 温度による系統発生パターンでは、MNTD は 54.8 °C の 0.117 ± 0.016 から 80 °C の 0.091 ± 0.015 に減少しました (R2 = 0.29、p < 0.001) (図 3C)。これは、系統発生の関連性が温度とともにより緊密になることを示しています。 一貫して、54.8 °C での 2.412 ± 0.229 から 80 °C での 6.470 ± 0.642 まで、温度とともに NTI の増加 (R2 = 0.40、p < 0.001) が観察されました (図 3D)。これは、温度が高いほど、より微細な系統でのより強い系統的クラスター化が促進されることをさらに示唆しています。系統樹の先端近くの分類レベル。 これらの結果は、シーケンス深度が深い V4 シーケンスでは堅牢でした（図 S5）。 さらに、Blomberg の K 統計により、温度に関する系統発生シグナルが他の環境変数よりも強いことが明らかになりました (図 3E)。 レビンスのニッチの幅は温度とともに狭くなりました（図3F）。 スピアマン相関はまた、シンプソンの多様性指数、種の豊富さ、MNTD、バイオマス、およびレビンズのニッチ幅に対する温度の負の影響（p < 0.05）と、NTIに対する正の影響を確認しました（図S6）。

T 感受性種と T 耐性種は、それぞれ狭い熱耐性または広い熱耐性に従って識別されました (図 4A)。 合計 26,070 の系統型が T 感受性種 (特定の温度でのみ見られる OTU レベルの種) として分類され、524 が T 耐性種 (5 ～ 8 つの温度で見られる OTU レベルの種) として分類されました (図 4A)。 T 感受性種の数は T 耐性種の数を上回り (2124 ～ 4,286 対 318 ～ 455)、両方の温度が 54.8 °C から 80 °C に低下し、T 感受性種の方が急峻な低下傾向を示しました (図 4B)。 種の豊富さにもかかわらず、T感受性種は、それらのT耐性種よりもはるかに少ないコミュニティ存在量（2.634×104対4.620×105、図4E）および配列比率（8.05％対83.6％、図S7A）を占めました。 さらに、T 感受性サブコミュニティの構造は、どのペアの温度グループ間でも大きな相違を示し、コミュニティ全体との重複はほとんどありませんでしたが (図 4C)、T 耐性サブコミュニティはコミュニティ全体と著しく高い相関関係がありました (図 4C)。 .4D）。 しかし、T 耐性種と比較して、T 感受性種はより強い系統的クラスター化を示し、NTI が高くなりました (図 4F)。 一貫して、T感受性種は、群集レベルのレビンニッチ幅が狭く（図S7B）、中立群集モデル（NCM）のNm値が低い（162対10429、図S7C）ことを示しました。

T 感受性種と T 耐性種の分類。 グループ化基準は、観察された分布と 100,000 の順列から導出された予想される分布を比較することによって取得されます。 観測された種 > 予想される種 N 個の場合にグループ化基準を選択しました。これは、示された温度グループ内の種がランダムに選択されないことを意味します。 この研究では、グループ化基準は 1 および 5 以上であり、これが、「T 感受性」種を特定の温度で発生する種と定義し、「T 耐性」種を少なくとも 5 つの温度で発生すると定義した理由の根拠となっています。 挿入図は、5 ～ 8 つの温度における種の濃縮を示しています。 B 温度全体にわたる T 感受性種と T 耐性種の豊富さ。 C、D それぞれ、T 感受性および T 耐性の群集構造と全体の群集構造との関係。 E ddPCR によって定量化された、温度による T 感受性種と T 耐性種の群集存在量の変動。 F T 感受性種と T 耐性種間のコミュニティ内最近接分類群指数 (NTI) の変動。 G 系統樹は、明確な分類学的所属を持つ 1555 種で構築されました。 各種は、最も豊富な OTU によって表されました。 枝と最も内側のリングの色は両方とも異なる門を表し、最も外側のリングの色は熱ニッチの幅 (T 感受性、T 耐性など) を表します。 棒グラフが差し込まれたリングは、温度ごとの各 OTU の相対存在量を示します。 温度と各温度での種の豊富さがリングの端にマークされました。

系統樹は、明確な分類学的所属を持つ種の代表的な配列を使用して構築されました (図 4G)。 種の相対的な存在量と数は温度グループによって異なりました。 54.8 °C から 80 °C までの種の豊富さは、それぞれ 301、309、318、318、322、365、520、および 536 であり、温度とともにわずかに増加する傾向を示しました。 選択された種は異なる門に分布しており、選択された種の大部分は T 感受性種に属し、少数の種は T 耐性種に属していました (1179 対 108)。

LTPサブツリー（表S3）に基づく温度グループにわたるT感受性種とT耐性種の進化特性（すなわち、種分化、絶滅、状態遷移率）の変動傾向は、統一系統樹に基づくものとほぼ同じでした。したがって、自己構築した統一系統樹に基づいて結果のみを報告しました。

最尤法による BiSSE モデルを使用して、温度グループ全体にわたる T 感受性種と T 抵抗性種の種ごとの平均進化速度パラメーター (つまり、種分化、絶滅、状態遷移速度) を推定しました (図 5A)。 このモデルによって温度グループ全体で得られた結果は、制約付き結果と制約なしの結果間の有意差 (ANOVA 検定、p < 0.001) によって証明されているように、信頼できるものでした (表 S4)。 54.8 °C という比較的低い温度は、T 感受性系統の種分化に有利であり (種分化率 λTs = 50.119)、これに伴い、T 感受性系統と T 耐性系統の間の低いがバランスの取れた可逆的移行 (tTs→Tr = 8.841 および tTr→Ts) が起こりました。 = 8.775) (図 5B および表 S4)。 57.2 ～ 63.9 °C の中間範囲では、最も注目すべき変化は、T 耐性種の種分化 (λTr) と絶滅率 (μTr) がそれぞれ 23.069 ～ 30.608 と 24.468 ～ 31.624 に増加したことです (図 5A、B、表S4）、T感受性系統からT耐性系統への有利な移行（tTs→Tr = 6.829〜8.333）は、その逆（tTr→Ts = 0.406〜0.738）よりも有利です（図5A、Bおよび表S4）。 68〜80℃の高温範囲では、T耐性種の絶滅速度はさらに急激に加速しましたが（μTr = 116.034〜189.436）、種分化速度（λTr）は再び0に戻りました（図5A、B）および表S4）。 高温では、中間温度よりも T 感受性系統から T 耐性系統への移行がより頻繁に起こります (tTs→Tr = 22.834 ～ 35.224)。 注目すべきことに、T感受性系統の絶滅率は温度グループ全体でゼロのままでしたが、80℃の非常に高い温度でのみピークに達しました（図5A、Bおよび表S4）。

T 感受性種と T 耐性種の進化に関する二値状態の種分化と絶滅 (BiSSE) モデル。 各状態には、個別の種分化 (λ)、消滅 (μ)、および状態遷移 (t) 速度があります。 B T 感受性種と T 抵抗性種の種ごとの種分化速度 (λTs 対 λTr)、絶滅速度 (μTs 対 μTr)、および移行速度 (tTs-Tr 対 tTr-Ts) の変動傾向。 C、D、E T 感受性種の多様化の可能性 (DPT、傾き EDP = 0.09 eV)、T 耐性種の生態学的フィルタリングの可能性 (EPTr、傾き EEP = 0.09 eV) に対する温度、1/kt の影響。 0.89 eV）とEPTrに対するDPTの相対強度（RSDP対EP）。 直線は通常の最小二乗回帰を使用してフィッティングされました。 X 軸は温度の逆数 (1/kT)、Y 軸はそれぞれ ln 変換された DPTS、ln 変換された EPTr、および ln 変換された DPT から EPTr でした。

種分化 (λ) および遷移 (t) 速度は微生物の多様性を増加させるように作用しますが、絶滅 (μ) は多様性を減少させるように作用します。 種の豊富さに対するこれらのプロセスの寄与を評価するために、多様化ポテンシャル (DP) 指数を DP = λ + t − μ として提案します。 温度の上昇により種が濾過されることを考慮して、絶滅率を使用して環境濾過ポテンシャル (EP) を EP = μ として表します。 DP と EP を T 感受性種と T 耐性種に適用することにより、T 感受性種 (DPT) の DP と T 耐性種 (EPTr) の EP は両方とも温度全体にわたって正であることがわかりました。最低気温。 より具体的には、DPTs と EPTr はどちらも温度とともに指数関数的に増加しました (R2 = 0.19、p < 0.001 (図 5C) および R2 = 0.63、p < 0.001 (図 5D))、EDP = 0.09 ± 0.02 eV の活性化エネルギーを当てはめました。 (図5C)およびEEP = 0.89 ± 0.09 eV (図5D)。 次に、MTE フレームワークの下で、多様化の可能性と環境フィルタリングの可能性の相対的な強さ (RSDP 対 EP) を評価しました。 具体的には、RSDP vs EP = DPTs(T)/EPTr(T) ∝ e^(EEP – EDP)/KT (「材料と方法」の導出を参照)。 EDP​​ > EEP の場合、多様化が環境フィルタリングを圧倒し、全体的な多様性は温度とともに増加します。そうでない場合、EDP < EEP の場合、環境フィルタリングが多様化より有利であり、全体的な多様性は温度とともに減少します。 我々の結果は、EDP < EEPおよびRSDP vs EPが温度とともに指数関数的に減少するという後者の状況とよく一致し（R2 = 0.70、p < 0.001）（図5E）、高温では環境フィルタリングが多様化よりも支配的であることを示しています。

より強力な環境フィルタリングとより大きなゲノム多様化が同じ環境状況内に存在する可能性があります[6]が、これらのプロセスがどのように相互作用して、温度などの環境勾配全体で微生物の多様性に影響を与えるかは不明でした。 ここでは、幅広い温度範囲 (54.8 ～ 80 °C) にわたる微生物叢の生態学的および進化的特性を調査するために、適切な配列決定および多変量解析手法を選択しました。 化石記録が不足しているため、原核生物の種分化と絶滅のプロセスを再構築することは大きな課題です[68]。 現存種の比較的堅牢な系統樹を構築することで、細菌と古細菌の進化的特徴についての洞察を得ることができます。 この研究では、データの堅牢性を確保するためのいくつかの戦略があります。(1) PacBio RSII シーケンスによって完全長 16S rRNA 遺伝子を選択し、高い微生物系統学的解像度を得る [39]。 （２）微生物系統パターンを計算するために種の豊富さの影響を制御または除去するＮＴＩおよびＭＮＴＤを使用する。 (3) LTP サブツリーと、独自の配列に基づく統一系統樹から得られたバイナリ状態の種分化および絶滅モデルの結果を比較します。 我々の結果は、ニッチスペシャリストとニッチジェネラリストが動的平衡プロセスを介して微生物の多様性を維持するために協力していることを実証しており、その根底にあるメカニズムには主にスペシャリストの適応的多様化、ジェネラリストのニッチ拡大、スペシャリストからジェネラリストへの移行が含まれる。

種の多様性は、生態学的側面と進化的側面の両方において、物理的 (ニッチ) 環境と生物学的 (生物的相互作用) 環境の両方によって決まります。 生態学の観点から、我々は以前、温度と種間の相互作用が堆積物群集の集合に影響を与える決定的要因であることを発見しました[6]。 この研究では、温度が進化を決定する重要な環境フィルターであることを裏付ける証拠がいくつかあります。 (1) 地熱泉は古代初期の地球に類似しており、環境温度は進化速度の主要な決定要因であり、進化を促進する最も顕著な要因です。地球の寒冷化初期における好熱菌の多様性の拡大[22]。 （２）温度は、より高いランダムフォレスト％ＭＳＥ値によって明らかにされる微生物群集構造の変動を促進する上でより重要な予測因子であった（図２Ｄ）。 （3）表現型の強いクラスタリングがあり、コミュニティ内のクラスタリングの程度は温度と関連しています（図3C、Dおよび図S5）。 (4) 温度は他の環境変数よりも高い系統発生シグナルを示します (図 3E)。 したがって、温度は研究対象の地熱生態系において最も重要なニッチ次元である可能性があります。 温度ニッチ軸を考慮すると、T 耐性 (少なくとも 5 つの温度で発生する可能性がある) 種と T 感受性 (特定の温度のみを占める) 種は、本質的に、それぞれ温泉環境におけるニッチ ジェネラリストとニッチ スペシャリストを表します。 実際、ニッチの幅が異なるこれらの種の生態学的（図4）と進化的（図5）のパフォーマンスに矛盾があることがわかりました。 たとえば、T感受性種の組成変化は比較的固定されたニッチ幅（温度点）で起こりました（図4C）。一方、T耐性サブコミュニティの組成回転は温度を超えて緩やかであり、コミュニティ全体を反映していました（図4C）。 .4D）。

ニッチの特殊化は種の種分化と適応率を高めると長い間議論されており[75]、限られたニッチ空間と資源をより細かく分割することでより多くの種の共存が可能になる可能性がある[26]。 具体的には、ニッチ専門家（すなわち、T感受性種）は、より狭いレビンズニッチ幅（図S7B）とR2の負の値によって証明されるように、局所環境条件（限られたスペースと資源）によって厳密に制約され、より強い分散制限を経験した。 NCM（表S5）、およびニッチジェネラリスト（つまり、T耐性）コミュニティ全体でより高いNm（図S7C）。 ニッチの拡大には、適応能力の低下 [76] とパフォーマンスの低下 [77] という代償が伴うことはよく知られています。 さらに、資源の制限により種の分化が強化されました [78]。 したがって、ニッチ専門家の地域固有性は、「家庭ニッチ」での最大の適合性と、種の多様化におけるより大きな利点を示しました。 実際、温度全体にわたって T 感受性種の種分化率が高いことが観察されました (図 5B および表 S4)。 さらに、T 感受性種の存在量が少ないことは、生物相互作用を減少させ[79]、高い種分化と種の豊富さを間接的に促進するのに有益である。 T 感受性種の方が T 耐性種よりもクラスター化された系統的関連性を考慮すると (図 4F)、温度を越えた T 感受性系統は同所性種分化を介して系統発生的に近い種から拡大する可能性がある [80, 81]。したがって、各温度は系統発生的により類似するように適応する可能性がある利用可能な資源が限られている中で、類似種間の競争が激化することにつながります。 しかし、存在量が少ないと、T感受性種と隣接する種との物理的接触が減少し、そのため競争排除が弱まり、かなり狭い生態的ニッチで同様の形質を持つより多くの種の共存が可能になり（図S7B）、それが最終的に局所的多様性を増加させました。 したがって、ニッチ専門家は、より少ないバイオマスとより狭いニッチ息を犠牲にして間接的により高い種分化率を獲得し、比較的高い多様性をさらに促進することが提案されました。

注目すべきことに、T耐性種の絶滅率の増加にもかかわらず、それらの種数は温度全体で同等であった(図4B)。これは主にT耐性種からT耐性種への移行速度の付随的な増加によるものである(図5および表)。 S4)。 T 感受性種から T 耐性種への継続的な移行により、T 耐性種の排除確率が異なる温度で比較的一定になります。 T 感受性種の T 耐性種へのこの移行は、T 感受性種と T 耐性種の間の「win-win」シナリオを暗示しています。T 感受性種（より制約された）は、T 耐性種への移行を通じてニッチ拡大を達成する必要があります。一方、T 耐性種は高度な種分化を通じて比較的安定した種プールを生成し、T 耐性種との動的なソースシンク関係を維持したため、T 耐性種は継続的な補充を獲得しました。 T 耐性種と T 感受性種の間には種分化と絶滅率の違いがあるにもかかわらず、それらは進化的に互いに関連しています。 この 2 つの間の非常に複雑な相互作用と相互依存の発見は、赤の女王理論の重要な要素と一致して、それらの共進化と共適応につながりました [82]。 温泉におけるニッチな専門家とニッチなジェネラリストの間の進化のダイナミクスのバランスが、進化を推進する生物学的要因である可能性があります。

我々はさらに、顕著なニッチ軸（例えば、この研究では温度）に応じた微生物の多様性に対する環境フィルタリングと多様化の相対的な寄与を解明した。 多様化対環境フィルタリングの相対強度は温度とともに指数関数的に減少し（図5D）、多様性の全体的な減少とよく一致しており、状況がよりストレスフルになった場合には環境フィルタリングが多様化よりも有利であることを示しています。 我々は、顕著なニッチ軸（温度など）に沿った多様性パターンの制御における生態学的プロセスと進化的プロセスのバランスをより適切に説明するための概念的枠組みを提案します（図6）。 激しい地球規模の変化に直面して、微生物はよりストレスの多い環境にさらされており、このフレームワークを他のストレスの多い環境にも適用することで、微生物の多様性が系統発生的な側面でどのように維持されるかについてより深い理解が得られる可能性があります。 ニッチの広さ、分散能力、進化的特徴の違いを考慮すると、ニッチ専門家のライフスタイルとニッチジェネラリストのライフスタイルの間の移行は、微生物が環境変動に適応するのに役立ちます。

温度が高くなると、環境のフィルタリングが強化され、その結果、群集の豊かさが減少し、群集の構造が再形成され、群集レベルの熱ニッチの幅が減少する可能性があります。 同時に、より高い温度は木のより細い先端での種分化を促進し、系統的距離の減少（すなわち、MNTD）と系統的クラスタリング（すなわち、NTI）の強化につながる。 環境のフィルタリングが種分化を圧倒すると、温度勾配に沿って微生物の多様性パターンが減少することが観察される可能性があります。 結果として生じる多様性パターンの根底にある進化的特徴は、ニッチ専門家（例えば、狭い温度範囲でのみ存在するT感受性種）とニッチジェネラリスト（例えば、T耐性種）の種分化、絶滅、移行速度の力学によって決定された。環境の極端な勾配（温度など）に沿って、広範囲の温度に耐えることができます。

配列決定データは、アクセッション番号 CRA007636 および CRA007773 で National Genomics Data Center (NGDC) データベースに保管されています。

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この研究は、中国国立自然科学財団によって支援されています (助成金番号 U1906223、41807316、91851106)。 CAS、新領域科学の主要研究プログラム (QYZDB-SSW-DQC026)。

Shang Wang、Ye Deng の著者も同様に貢献しました。

CAS 環境バイオテクノロジー主要研究所、中国科学院 (CAS)、生態環境科学研究センター、北京、100085、中国

Qing He、Shang Wang、Kai Feng、Danrui Wang、Xi Peng、Xingsheng Yang、Ye Deng

中国科学院大学資源環境学部、北京、100190、中国

Qing He、Danrui Wang、Xi Peng、Xingsheng Yang、Ye Deng

ブリティッシュコロンビア大学植物学生物多様性研究センター、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、V6T 1Z4、カナダ

ショーン・T・ミカレッツ

生物地質および環境地質の国家重点実験室、中国地質大学、北京、100083、中国

Weiguo Hou、Wenhui Zhang、Fangru Li、Yidi Zhang

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QH、SW、KF、YD が実験を考案、設計し、QH、KF、WH、WZ、FL、YZ、DW が実験を実行しました。 QH、XP、XY がデータを分析し、QH、SW、STM、YD がデータマイニングを指導し、論文を執筆しました。 著者全員がこの論文を確認し、同意しました。

Shang Wang または Ye Deng との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

He、Q.、Wang、S.、Feng、K. 他。 ニッチな温泉専門店の種分化率が高い。 ISME J (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01447-4

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受信日: 2022 年 12 月 1 日

改訂日: 2023 年 5 月 24 日

受理日: 2023 年 5 月 26 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01447-4

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