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Jun 15, 2023

解離した網膜ニューロンおよびグリアの挙動に対する空間的閉じ込めの影響を研究するためのフラクタル電極とグリッド電極の比較

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 17513 (2022) この記事を引用

903 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

電極の形状と材料組成が網膜細胞の生存と挙動に及ぼす影響を理解することは、基礎的な細胞研究と神経調節応用の両方にとって重要です。 私たちは、C57BL/6J マウスの解離した網膜細胞が、二酸化ケイ素基板上に成長させた垂直配向カーボン ナノチューブでできた電極とどのように相互作用するかを調査します。 空間的閉じ込めの度合いが異なる電極、具体的には、それぞれ電極間のギャップが接続されたものと切断されたものを特徴とするフラクタル電極とグリッド電極を比較します。 どちらの電極でも、ニューロンプロセスは主にギャップ表面ではなく電極上に蓄積し、この挙動はグリッド電極で最も強いことがわかります。 しかし、グリッド電極ギャップの「閉じた」特性により、グリアがギャップ表面を覆うことが妨げられます。 このグリッドのグリア被覆の欠如は、ニューロンの生存と電気活動に長期的な悪影響を与えると予想されます。 対照的に、フラクタル電極内の相互接続されたギャップはグリアの被覆を促進します。 我々は、2 つの電極に対する異なる細胞応答を説明し、電極と相互作用する際にニューロンとグリアの両方の陽性反応を最大化する最適な形状が存在するという仮説を立てます。

人間の神経系の細胞と相互作用するように設計された人工装置についての基本的な理解を得ることへの関心が高まっています。 これらのデバイスを体内に埋め込むと、視覚系の一般的な例として網膜色素変性症や加齢黄斑変性症など、多くの神経変性疾患の診断と治療に重要な応用ができる可能性があります1、2、3、4、5、6。 7。 ニューロンを刺激する電極を備えたデバイスの場合、電極の設計はグリアとの相互作用にも対応する必要があります。 ニューロンとグリアは同時期に発見されましたが、後者の研究は、中枢神経系に広く存在し9、ニューロンネットワークの構造と機能の制御において中心的な役割を果たしているにもかかわらず、研究の勢いが鈍っています8。 医療機器の性能を向上させることに加えて、電極に対するこれら 2 種類の細胞の反応の違いを調べることは、基本的な網膜細胞の挙動とその挙動をどの程度制御できるかを調査するために使用できます。

グリアの存在を制御する戦略では、グリアのプラスの影響とマイナスの影響のバランスを取る必要があります。 グリアからの炎症反応やその他の反応は、インプラントの挿入と神経組織に対するインプラントの微小な動き 11、12、13、14、15、およびインプラントの機械的特性 (剛性など) と組織との不一致によって引き起こされる可能性があります 16、17。 。 これらの影響により、電極を標的ニューロンから分離し、その刺激力を低下させるグリアの「瘢痕」が構築される可能性があります。 一方で、グリアを完全に除去することを目的とした技術は、神経細胞の生存、健康、電気活動に長期的に悪影響を及ぼします18。 これは、グリアがニューロンの生命維持システムとして機能し、ニューロンの移動に自然な物理的合図を提供し 19,20,21 、ニューロンの機能を調節し、健康を維持し 23、シナプス効果を高めるのに役立つ 24 ためです。

グリア反応を制御する戦略を同時に実行して、侵襲性が最も低いインプラントを作成することができます。 これらには、インプラントのサイズを小さくする25、機械的不一致を減らす17、表面の多孔性を高める26,27、異物反応から潜在的に隠すためにインプラントを生体模倣または生物活性コーティングで覆う13が含まれます。 たとえば、リソグラフィーを使用したナノ粗さまたはマイクロコンタクトプリンティングの導入による表面の物理的構造の変更は、神経膠症反応の軽減を含む多くの目的で細胞の付着と誘導を制御するためにも使用されています 31。

多様なナノ/マイクロパターン構造が、グリア細胞および神経細胞との相互作用について研究されています 27、29、31、32、33、34、35、36。 ニューロンの成長は、細胞外マトリックス (ECM) 構造によく似ている 41、42 ため、柔らかくテクスチャーのある表面によって強化されます 37、38、39、40。 対照的に、細胞の成長と分裂によるグリアの被覆は、表面相互作用が弱まった結果として、テクスチャーのある基材やより柔らかい基材では弱まります 17,32,43,44,45,46,47。 これらの結果と一致して、細胞の共培養を用いた実験では、ニューロンがナノワイヤーの列に蓄積するのに対し、グリアはそれらの間の平らな領域に蓄積することが実証されました 31。 これらすべての努力にもかかわらず、さまざまな種類の細胞とさまざまな表面との相互作用を制御するメカニズムはまだ完全には理解されていません。

私たちの研究は、グリア反応および関連するニューロンの挙動を制御するための電極材料特性と組み合わせた電極形状の重要性に焦点を当てています。 当社では、網膜ニューロンとグリア48を用いた以前のテストに基づいて、電極の導電性材料として純正のカーボン ナノチューブを採用しています。 さらに、以前の研究では、グリア瘢痕組織の形成を減少させるそれらの能力が強調されており 49、ニューロンを効果的に刺激し 50,51,52 、信号伝達を促進する能力が実証されています 53,54,55,56。

二酸化ケイ素 (SiO2) 基板上に垂直に整列したカーボン ナノチューブ (VACNT) を成長させることにより、テクスチャ電極 (VACNT) と滑らかなギャップ (SiO2) の横方向にパターン化された領域を生成します。 異なるテクスチャに対する細胞応答に関する上記の研究に基づいて、VACNT 領域は主にニューロンを蓄積する一方、滑らかな SiO2 領域はグリアを蓄積するように設計されています。 この設計により、VACNT 領域は、通常は網膜のグリアによって提供されるニューロンの足場として機能します。 この足場の隙間にグリアが蓄積することで、最大限の刺激に必要なニューロンと電極の相互作用を物理的にブロックすることなく、電極上のニューロンに栄養および代謝のサポートを提供できるほど十分に接近します。 高さ約 25 μm の VACNT 電極はグリアに対する障壁として機能するため、SiO2 表面全体にグリアがカバーされるよう誘導する可能性があります。 私たちの研究では、VACNT 電極が制限壁によって互いに切り離された一連のギャップを形成する「閉じた」システムと、電極が互いに分離されている「開いた」システムを考慮することにより、細胞の挙動に対する閉じ込めの影響を調査しています。接続されたギャップに囲まれています。

ここでは、さまざまな「閉じた」および「開いた」設計の包括的な研究を行うのではなく、電極の用途に適した 2 つの例に焦点を当て、将来の電極設計に役立ついくつかの基本的なセルの動作を示します。 この目標を達成するために、グリッド電極とフラクタル電極は、これら 2 つの設計の魅力的な例として機能します。 両方とも、ニューロンおよび/またはグリアとインターフェースする電極として以前に検討されてきました57、58、59、60、61、62、63、64、65。 各形状について、VACNT は電極のバイアスを容易にする連続ネットワークを形成します (補足情報)。 さらに、それらの幾何学的形状によって生成される大きな電気容量はニューロンの刺激を強化すると予測されており 57 、両方ともギャップを通した光の伝達を可能にします。 ただし、これらの特性は、好ましい細胞応答を伴う場合にのみ有益です。 私たちのグリッドに関する研究は、人間の脳生検から生成されたグリアが金属製のグリッド パターンのチャンバー内に閉じ込められる可能性があることを示した 1978 年の先駆的な研究に基づいています 65。 この「密閉」システムは、幅約 100 μm の切り離されたチャンバーの配列を特徴としていました。 ここでは、いくつかのグリア細胞体とプロセスを収容するのに十分な大きさである幅 60 μm の同様のサイズのチャンバーを作製します。 ただし、元の研究ではグリアのみの培養が特徴でしたが、本発明者らは、グリアとニューロンの間の相互作用の研究を可能にするために共培養を採用しました。 VACNT 電極幅は WCNT = 20 µm に選択されます。 この幅により、いくつかのニューロンの細胞体が VACNT 表面に付着し、その突起が細胞体から電極表面全体に成長することが可能になります。

「開いた」システムの選択に関して言えば、フラクタル分岐は自然界に広く普及しています66、67、68。 植物、樹木69、河川70に加えて、気管支71、心臓血管69、神経ネットワーク72はすべてフラクタル分岐を特徴としています。 それらの枝は空間に広がり、2 つの埋め込まれたフラクタル パターン (枝と枝の間に形成されるギャップ) を生成し、それらの構造的な関係は機能の強化につながる可能性があります。 特に、マルチスケールのギャップは、貫通する枝と効率的に接続する相互接続されたシステムを形成します。 たとえば、この間隙と枝の相互作用は、樹木では光への曝露を促進し 73、気管支樹では酸素移動を促進します 74 が、著者らによって行われた最近の研究では、VACNT から作製されたフラクタル電極を用いたグリアニューロン相互作用が調査されました 59。 当社の電極は、複数のスケールで繰り返される「H ツリー」形状を特徴としています (図 1)。 グリッドとの比較を容易にするために、VACNT 電極幅は 20 μm に選択され、最小ギャップ幅 (補足情報を参照) 60 μm はグリッド電極のチャンバー幅と一致します。 このサイズにより、グリアはフラクタル電極内のますます大きくなるギャップに接続することができ、相互接続されたチャンバーのセットとして見ることができます。

リソグラフィ マスクの設計と、グリッドおよびフラクタル電極の走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像。 (a、b) それぞれグリッド電極とフラクタル電極のバイナリ マスク。 (c、d) (a) と (b) の赤いボックスの拡大図。2 つの電極の幾何学的パラメーターの一部を示しています (定義については「材料と方法」セクションと補足情報を参照)。 （ e 、 f ）それぞれグリッド電極とフラクタル電極の（a）と（b）の赤いボックスに相当する領域内のVACNTのSEM画像。 (a) と (b) のマスク サイズは正確な縮尺です (相対的なサイズについては表 1 を参照してください)。 (e) と (f) のスケール バーは、それぞれ 50 μm と 200 μm です。

解離したマウス網膜ニューロンとグリアの共培養を使用した in vitro 実験を検討します。これは、蛍光顕微鏡を使用して、17 日間の in vitro (DIV) で進化する細胞の挙動と細胞電極相互作用を調べることができる制御された環境を提供するためです。 。 定性的および定量的観察を使用すると、グリッド電極が切り離されたチャンバー内にグリアを捕捉し、滑らかな SiO2 領域をカバーするのを妨げていることがわかります。 対照的に、フラクタル電極はグリアに分裂と成長の機会を提供し、徐々に大きくなる接続された SiO2 領域をカバーします。 どちらの電極もニューロンの接着、成長、生存をサポートしますが、フラクタル電極と比較すると、グリッド電極が VACNT 表面と SiO2 表面の両方で最大のニューロンプロセス密度を促進することがわかりました。 それらの「閉じた」ジオメトリにより、2 つの表面間の界面エッジに対するニューロンの近接性が高まります。 これらの端はニューロン細胞体のアンカーポイントとして機能し、そのプロセスの成長と他のニューロンへの接続を促進します。 細胞の健康と刺激に対する 2 つの細胞タイプの相互作用の影響について説明します。

繰り返しレベルの数が m = 5 であり、これらのレベル間の収縮率を設定するフラクタル次元 D = 2 に基づいて H ツリー ジオメトリを作成しました (m、D、およびこのセクションで説明する関連する幾何学的パラメータ)59。 WCNT = 20 μm および WSi-min = 60 μm と組み合わせると、これらのパラメーターにより、WSi-max = 3.22 × 103 μm の最大電極分離距離と、W = 6.26 × 103 μm の電極全体の幅が生成されます (表 1、補足図) .S1)。 グリッドの WCNT はフラクタルと等しく設定され、電極全体の幅は W = 3.51 × 103 μm (1 列あたり 43 チャンバーに相当) に設定され、ほぼ同じ合計エッジ長 E とほぼ同じ被覆面積が得られました。 、ACNTをフラクタル電極として使用します。 E は、ニューロンが豊富な電極とグリアが豊富なギャップの間の相互作用境界を表すため、標準化されました。 ACNT はまた、セルとの初期相互作用中に両方の電極で同様の量の VACNT 材料と同様の断面積を確保するために標準化されました。 2 つの電極は基本的に異なるジオメトリ (マルチスケールのフラクタルとユニスケールの「ユークリッド」グリッド) に属しているため、すべてのパラメーターを制御することは不可能であることに注意してください。その結果、2 つの電極の境界は異なります。面積、Abounding、および SiO2 表面積、ASi。 また、すべてのフラクタル幾何学的パラメーターは D、m、W、および WCNT の関数として計算されているため、相互依存していることにも注意してください。 表 1 は、2 つの電極設計のさまざまなパラメータをまとめたものです。

微細加工およびリソグラフィー技術を使用して、他の場所で詳細に説明されている手順に従って VACNT フラクタルおよびグリッド電極を合成しました 48。 簡単に説明すると、300 nm の熱酸化物 (SiO2) 上層を備えた 2 インチのシリコン ウェーハを洗浄し、フォトリソグラフィー技術を使用してパターン化しました。 ウェーハ全体には、10 個の個別のグリッドと 8 個の個別のフラクタル電極が含まれていました。 フォトレジストの現像後、2 ～ 5 nm のアルミニウム (Al) 接着層が熱蒸着され、続いて 3 ～ 5 nm の鉄 (Fe) 触媒層が電子ビーム蒸着されました。 フォトレジスト層を剥離するために超音波処理を伴うアセトン浸漬を 30 秒間行った後、ウェーハを個々のサンプルに切断し、各サンプルは 1 つの電極を備えていました。 作製したサンプルのすべてが解離細胞培養実験に使用されたわけではありません。 一部のサンプルは目に見える欠陥があるため除外されたか、さらなる SEM 特性評価のために保存されました。 化学蒸着 (CVD) 技術を使用して、2 インチの石英管内の触媒パターン上に VACNT を合成しました。 エチレン (C2H4):水素 (H2) の 2:1 混合物 (それぞれ 200 および 100 SCCM) と 600 SCCM のアルゴン (Ar) 流を伴って、650 °C で 3 分間の成長時間の間維持されました。 この技術により、VACNTの絡み合った「フォレスト」からなるパターン化された電極が得られました（図1、補足図S2）。 次いで、電極をデシケーターキャビネット内の集積回路トレイに保管した。 ＶＡＣＮＴの上面および側壁、それらの高さおよび一般的な状態は、ＺＥＩＳＳ−Ｕｌｔｒａ−５５走査型電子顕微鏡を使用して検査された。 2 つの電極設計および製造実行からのサンプル間に視覚的な違いは観察されませんでした。 VACNT の高さは 16 ～ 36 µm の範囲でした。 培養中、サンプルを 4 ウェル培養プレート (Sarstedt、ニュートン、ノースカロライナ州) に 1 ウェルあたり 1 サンプルずつ入れました。

野生型 C57BL/6J マウスは、オレゴン大学 (UO) の動物福祉サービスで飼育され、新鮮な水と食料が常時入手可能でした。 マウスの取り扱いおよび培養手順は、プロトコル 16-04 に基づいて UO の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルに従って、ARRIVE ガイドラインおよび実験動物の管理および使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従って実行されました。動物。 解離した網膜細胞培養物は、他の場所に記載されているプロトコールを使用して使用されました31、48、75。 簡単に説明すると、生後 4 日目 (PN4) マウスを断頭して安楽死させ、その網膜をすぐに解剖し、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、およびフェノールレッドを含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM - ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) に保管しました。 。 各培養実験では、4 つの網膜を DMEM、パパイン (Worthington Biochemical Corporation、ニュージャージー州レイクウッド)、および l-システイン (Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス) を含む酵素溶液に移しました。 消化された網膜を DMEM で注意深く洗浄し、B27 (Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス) および l-グルタミン - ペニシリン - ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス) を含む新しい DMEM に移しました。 解離した網膜溶液を遠心分離し、細胞ペレットをDMEM/B27/抗生物質溶液に再懸濁した。 続いて、細胞懸濁液 (500 μL) を、グリッドまたはフラクタル電極のいずれかを含む各ウェルに播種しました。 細胞を 37 °C、5% CO2 で 17 DIV 培養しました。 培地を最初は３ＤＩＶで交換し、その後は培養時間が終了するまで１日おきに交換した。 異なる種類の表面へのニューロンおよびグリアの接着を高めるために、ポリ-D-リジン (PDL) またはポリ-L-リジン (PLL) で表面をプレコーティングするなどのプロトコルは使用されていません。 血球計で測定した生細胞密度は (3.7 ± 0.4) × 106 細胞/mL でした。

免疫細胞化学プロトコールは、他の場所で詳細に説明されています31、48、75。 簡単に説明すると、細胞を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定し、リン酸緩衝液 (PBS) ですすぎ、PBS、Triton-X (Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス)、ウシを含む完全 PBS 中でプレインキュベートしました。血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）、ヤギ正常血清およびロバ正常血清（Jackson ImmunoResearch、ペンシルバニア州ウェストグローブ）。 続いて細胞を、一次抗体、マウス抗β-チューブリン III (マウス網膜のいくつかのニューロンタイプのニューロンマーカー 76,77 - Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州) およびウサギ抗グリア原線維を含む完全 PBS とともにインキュベートしました。酸性タンパク質 (GFAP; グリアマーカー - Agilent、カリフォルニア州サンタクララ) を 4 °C で一晩静置します。 次いで、細胞をすすぎ、二次抗体Cy3ヤギ抗マウスIgGおよびAlexaFluor 488ロバ抗ウサギIgG（Jackson ImmunoResearch、ペンシルバニア州ウェストグローブ）を含むPBS-completeとともにインキュベートした。 次いで、二次抗体溶液を除去し、細胞をPBSですすいだ。 サンプルを顕微鏡スライドに移し、DAPI (DNA に結合する蛍光細胞核マーカー - Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州) を含む Vectashield でマウントしました。

Leica DMi8 倒立蛍光顕微鏡を使用して、Cy3 (550 nm で励起、570 nm で発光ピーク)、AlexaFluor 488 (493 nm で励起、519 nm で発光ピーク)、および DAPI (358 nm で励起) の 20 倍画像を撮影しました。 、461 nm の発光ピーク）すべての電極のチャネル。 VACNT の上部表面と SiO2 の下部表面は、これらの表面に焦点を合わせて別々に画像化されました。 次に、各チャネルの 2048 × 2048 ピクセル 2 (662.65 × 662.65 µm2) の視野 (FOV) を、自動ステッチング アルゴリズムを使用して、隣接する FOV の端で 10% オーバーラップするようにステッチして、完全な電極画像を作成しました。

我々は、神経細胞の健康と機能の形態学的表現型の測定としてニューロンのプロセス成長を選択しました78,79。 これは、部分的には、ニューロン刺激に電極を使用するという長期目標と突起上の刺激部位の高密度に基づいていた。 定量的分析には、突起の密度（つまり、所定の表面積内のニューロンの樹状突起と軸索の全長）の計算が含まれていました。 ニューロンの恒常性と生存を促進するというグリア細胞の役割に基づいて、グリア解析は細胞骨格マーカー GFAP32 を発現する表面積の定量化に焦点を当てました。 この分析には、それらの表面被覆密度（以下「被覆」と呼ぶ、すなわち、利用可能な総表面積に対して正規化されたグリアによって覆われた表面積）の計算が含まれた。

この定量分析を実行するために 59、蛍光画像の DAPI チャネルを使用して測定された WCNT に基づいて、フラクタルおよびグリッド電極のバイナリ マスクが MATLAB アルゴリズムを使用して作成されました。 次に、これらのマスクを各電極の許容可能なすべての FOV に適用して、SiO2 表面と VACNT 表面を個別に分析できるようにしました。 許容できない FOV (たとえば、VACNT 変形などの異常があるもの) はまれで、通常は 50 FOV のうち 2 つでした。 自動画像解析 MATLAB アルゴリズムをバイナリ マスク アルゴリズムと統合して、SiO2 表面と VACNT 表面の FOV ごとのプロセス長を個別に検出および測定しました。 プロセスが物理的に重なっている場合 (たとえば、プロセスが「束ね」られて表面上の共通のルートをたどる場合、または複数のプロセスが同じ電極エッジをたどる場合)、アルゴリズムはこれらを 1 つのプロセスとして検出しました。 これにより、特に VACNT 表面のプロセスが過少カウントされることになりましたが、実験の一般的な結果には影響しませんでした。 各電極について、SiO2 (NSi) および VACNT (NCNT) 表面の正規化されたプロセス長は、すべての FOV (NLSi または NLCNT) にわたる各表面の合計プロセス長を、その表面の総面積で割った値として定義されました。電極 (ASi または ACNT):

グリアについては、バイナリ マスク アルゴリズムと統合された半自動閾値処理 MATLAB アルゴリズムを使用して、SiO2 および VACNT 表面上の FOV ごとのグリア面積を個別に検出および測定しました。 各電極について、SiO2 および VACNT 表面上の正規化されたグリア面積は、すべての FOV (GASi または GACNT) にわたる各表面の合計グリア面積をその表面の合計面積で割ったものとして定義されました。

両面の電極の端の周りのニューロン突起長とグリア領域の検出誤差を最小限に抑えるために、焦点の合った特徴を正しく検出できるように、FOVを検査し、必要に応じてマスク測定を手動で調整しました（補足図S3を参照）フラクタル電極の VACNT 表面上のグリア被覆率およびニューロン プロセス検出アルゴリズムの例)。

Shapiro-Wilk 検定は、ニューロンおよびグリアのパラメーターの正常性を判断するために実行されました。 一部の分布は正規性基​​準を満たしていないため、MATLAB でノンパラメトリックなクラスカル・ワリス有意差比較 (有意水準 0.05) を使用して、ニューロンおよびグリアのパラメーターの中央値をさまざまな帰無仮説 (たとえば、GSi と GCNT は表面物質はグリアの挙動に影響を与えないという帰無仮説に対して検証されました)。 外れ値は、Q1-1.5IQR として設定された最小値を下回るデータポイント、または Q3 + 3IQR として設定された最大値を超えるデータポイントとして決定されました。ここで、Q1、Q3、および IQR は、25% 四分位、75% 四分位、および四分位間範囲を表します ( Q3–Q1）それぞれ。 実験では、3 つの独立した培養物からの合計 7 つのグリッド電極と 5 つの独立した培養物からの 11 つのフラクタル電極が使用されました。 一部のサンプルは、製造または培養手順の複雑さのために除外されました。 それぞれの独立した培養には両方の電極設計が含まれていました。

まず、細胞の挙動の定性的観察に焦点を当てます。 図2および補足図S4は、電極と細胞の相互作用の代表的な蛍光画像を示しています。 グリアは、17 DIV で両方の電極の SiO2 表面と VACNT 表面の両方で観察されました。 SiO2 上に存在するグリアは、VACNT 表面上にプロセスを拡張することはありませんでした。 形態の観点から見ると、グリアは両方の電極の SiO2 表面上に複数の明確に定義された長い突起を備えた広がった形状を示しました。 対照的に、両方の電極の VACNT 表面では、より細長い形態を持っていました。 これらは VACNT 表面の形状に従い、まれではありますが、VACNT の転換点で 90° 回転することさえありました。

17 DIV でグリッドおよびフラクタル電極と相互作用する網膜細胞の蛍光画像の代表例 (緑 = GFAP 標識グリア、赤 = β-チューブリン III 標識ニューロン、青 = DAPI 標識核)。 (a) グリッドおよび (b) フラクタル電極の VACNT 表面上のグリア。 (c) グリッドおよび (d) フラクタル電極の SiO2 表面に蓄積するグリア。 (e) グリッドおよび (f) フラクタル電極の VACNT 表面、ならびに (g) グリッドおよび (h) フラクタル電極の SiO2 表面上のグリアの構造。 ニューロンは、(i) グリッドおよび (j) フラクタル電極の VACNT 電極に従って処理します。 (k) グリッド チャンバー内のニューロン クラスターがプロセスを VACNT 側壁に向けて送信します。 (l) フラクタル電極の VACNT 表面上のニューロンに接続する SiO2 表面上の大きなニューロン クラスター。 ニューロンは、(m) グリッドの VACNT 電極と (n) フラクタル電極に従って処理します。 (o) グリッド チャンバーの VACNT 側壁に付着したニューロン クラスターが、SiO2 表面と VACNT 表面の両方にプロセスを送信します。 (p) フラクタル電極の SiO2 および VACNT 表面上のニューロン クラスターと接続プロセス。 (c) と (k) の画像は、(d) と (l) と同じ FOV を示しています。 パネル (i)、(j)、(m)、および (n) を除き、電極のエッジは白い線で強調表示されています。パネル (i)、(j)、(m)、および (n) では、線がこれらのプロセスを隠してしまうため、エッジに沿ったプロセスの動作に焦点を当てています。 スケール バーは次のとおりです: (e) および (f) では 10 μm。 (g)、(h)、(m)、(n)、(o) では 20 μm。 (p) で 40 μm; (a)、(b)、(c)、(i)、(j)、(k) では 50 μm。 (d) と (l) では 100 μm。

ニューロンは、フラクタル電極とグリッド電極の SiO2 表面と VACNT 表面の両方のプロセスに付着し、成長しました。 両方の表面で、ニューロン細胞体が時々クラスター化し、クラスターを接続する突起の一部が束を形成しました。 この挙動は、VACNT 表面よりも SiO2 表面でより頻繁に観察されました（図 2i-l）。 2つの表面上のニューロンは、VACNT側壁に付着したクラスターを介して接続されており、側壁の上端と下端に沿ってプロセスが頻繁に観察されました（図2、補足図S4）。 SiO2 表面上の大きなクラスターは、特に大きなグリア被覆を伴う領域では、グリッド電極よりもフラクタルの方がはるかに一般的でした。 一部のグリッド チャンバーでは大きなクラスターが時折明らかですが、これはグリアが存在する場合に最も頻繁に発生しました。 たとえば、図 2c および k では、中央の部屋 (グリアが存在しない) のクラスターは、周囲の 4 つの部屋 (グリアで占められている) のクラスターよりも小さく見えます。

次に定量的な測定に移ります。 まず、グリッド電極とフラクタル電極について個別に GSi 対 GCNT、NSi 対 NCNT の統計的比較を通じて、2 つの表面上のグリアおよびニューロンの分布に対する SiO2 – VACNT 材料系の影響を研究しました。 グリッドでは GSi と GCNT の間に有意な差はありませんでしたが (図 3a)、フラクタルでは GSi が有意に高かったです (p = 0.0002、図 3c)。 NSiは、グリッドとフラクタルの両方でNCNTよりも大幅に低かった（それぞれp = 0.0017と0.0053、図3b、d）。

17 DIV でのグリッド電極とフラクタル電極の SiO2 表面と VACNT 表面上のグリアとニューロンの挙動の比較。 (a) グリッドおよび (c) フラクタルについて GSi (左) を GCNT (右) と比較した箱ひげ図、および (b) グリッドおよび (d) について NCNT (右) と比較した NSi (左) の箱ひげ図を示す統計分析。フラクタル。 (a) と (c) の y 軸は GSi と GCNT の値の範囲を表示し、(b) と (d) の y 軸は NSi と NCNT の値の範囲を表示します。 パネル (b ～ d) の星印は有意度を示します。*** と ** はそれぞれ p ≤ 0.001 と p ≤ 0.01 を示します。 パネル (d) の赤いプラスは外れ値です。 GSi と GCNT には単位がなく、NSi と NCNT には µm−1 の単位があることに注意してください (「材料と方法」セクションを参照)。

各電極設計のグリアとニューロンの分布に対する SiO2 領域と VACNT 領域の影響を個別に評価した後、目的の細胞分布 (つまり、VACNT 領域と SiO2 領域にニューロンとグリアが集中する) の達成における 2 つの電極の成功を比較しました。それぞれ）。 図 4a と b は、グリッド電極とフラクタル電極の GSi 対 GCNT、NCNT 対 NSi の散布図を示しています。 黒い線は、GSi = GCNT および NCNT = NSi の条件を表します。 すべてのフラクタルは GSi > GCNT という条件を達成することに成功しましたが、達成できたのは 7 つのグリッドのうち 2 つだけでした。 一方、すべてのグリッドは NCNT > NSi の条件を達成することに成功しましたが、11 フラクタル中 9 つが成功しました。 赤と青の実線は、グリッドとフラクタルのゼロを通るものであり、目のガイドとして含まれています。 これらの線形ガイドは、データを GSi = GCNT および NCNT = NSi 条件 (黒い線の傾きで表されます) と比較するのに役立ちますが、厳密に線形の動作を暗示するためにこれらの近似を使用しているわけではありません (R2 値は次の値に等しい)。グリッドでは 0.06、フラクタル GSi 対 GCNT フィットでは 0.32、グリッドでは 0.71、フラクタル NCNT 対 NSi フィットでは 0.41)。

グリッドおよびフラクタル電極についての GSi と GCNT、および NCNT と NSi の関係の研究。 (a) グリッド (赤) とフラクタル (青) の GSi 対 GCNT の散布図。 (b) グリッド (赤) とフラクタル (青) の NCNT 対 NSi の散布図。 黒の実線は、それぞれ (a) と (b) の GSi = GCNT および NCNT = NSi 条件を表します。 赤の実線と青の実線は、それぞれグリッドとフラクタルのゼロを通るフィッティングです。

最後に、グリッド電極とフラクタル電極を 4 つのパラメータ (GSi、GCNT、NSi、NCNT) ごとに直接比較しました。 グリアの挙動に関しては、統計的比較の結果、フラクタルはグリッドよりも有意に高い GSi を有し (p = 0.0018、図 5a)、グリッドはフラクタルよりも有意に高い GCNT を有することが確認されました (p = 0.0164、図 5b)。 。 ニューロンの動作を考慮すると、グリッドはフラクタルと比較して有意に高いNSiとNCNTを持っていました（それぞれp = 0.0333と0.0013、図5c、d）。 図 1 と図 2 のフラクタル外れ値。 3d と 5c の NSi が最も低いのは、おそらくすべてのフラクタルの中で GSi 値が最も低いためです (この低い GSi は、文化内の異なる電極間のばらつきによるものです)。

SiO2 および VACNT 表面上のグリアおよびニューロンの挙動に関する 17 DIV でのグリッド電極とフラクタル電極の比較。 グリッド電極とフラクタル電極間の (a) GSi、(b) GCNT、(c) NSi、および (d) NCNT の箱ひげ図を示す統計解析。 すべてのパネルの星印は有意度を示します。** と * はそれぞれ p ≤ 0.01 と p ≤ 0.05 を示します。 パネル (c) の赤いプラスは外れ値です。

私たちの実験は、グリアがテクスチャーのある表面ではなく滑らかな表面に蓄積するという確立された挙動に依存していました 31,44,45,48。 これまでの研究のほとんどは、異なるテクスチャーを特徴とする単一の材料で作られた基板上の純粋なグリア培養を調査していましたが、ここでは、さまざまな細胞タイプが存在することを確認するために、マルチマテリアルシステム（滑らかなSiO2とテクスチャード加工されたVACNT）上の網膜ニューロンとグリアの共培養に焦点を当てました。共培養内では、表面テクスチャーの操作を通じて、異なる領域に蓄積させることができます 31。 これを達成するために、我々は、パターン化されていないナノ粗面を使用した以前の研究とは対照的に、VACNT (平均高さ 25 μm) のミクロンスケールの横方向パターニングとその表面ナノ粗さ効果を組み合わせました。波紋と微細溝46、およびナノワイヤ31。 予想どおり、2 つの表面で観察された細胞形態は、以前のテクスチャ研究で観察されたものと一致していることがわかりました 32,59。 しかし、VACNT の高さが大きいことが、システム設計における重要な要素であることが示されました。SiO2 上に存在するグリアは、VACNT 表面上にプロセスを拡張することはありませんでした。 このように、VACNT 電極はグリアに対する障壁として機能し、したがって SiO2 表面全体にわたるグリアの被覆を誘導しました。 グリアの挙動に対するギャップ サイズの影響を考慮すると、フラクタル設計における最小のギャップ サイズである WSi-min は、WSi-min に位置するグリアの拡張された形態によって示唆されるように、フラクタル ギャップ間にグリアの適用範囲が広がることを妨げませんでした。ギャップ（図2d、補足図S4）。 したがって、フラクタル電極内の最小のSiO2領域はますます大きな領域に接続され、グリアにこれらの大きな領域全体にわたってカバー範囲を自由に拡大できるようになりました（補足図S4）。 グリッドチャンバーのサイズはフラクタル電極のWSi-minと一致しましたが、グリッド電極の切断された特性により、1つのチャンバーに存在するグリアが電極の他の領域にアクセスすることが妨げられました（図2c）。 これにより、グリッド電極内のグリアのない領域が残り、その結果、グリッドのGSi値がフラクタル電極よりも大幅に低くなりました（図5a）。 グリアがニューロンの生命維持システムとして機能し、グリアの存在がニューロン間のシナプス接続を大幅に改善することがよく知られているため、これは長期的にはニューロンの生存と機能に重大な悪影響を与える可能性があります82。

SiO2 表面上でのニューロンの挙動を考えると、ニューロンはその発達と生存のために表面接着に依存しています。 ＶＡＣＮＴ側壁に近接しているため、グリッドチャンバー内のニューロンは、より大きなフラクタルギャップ内のニューロンよりも電極エッジに沿って突起に付着して成長する可能性が高かった。 SiO2 表面ではなく側壁へのプロセスのこの誘引は、VACNT 表面上のニューロンおよびグリアからの化学シグナル (神経栄養因子) 83,84,85,86 によってさらに促進された可能性があり、グリッドの NSi が VACNT 表面に比べて低下する可能性があります。フラクタル。 ただし、別の接着関連の挙動が優勢となり、フラクタルの NSi が最低になったと仮説を立てます。 ニューロンが経験する強力な細胞-VACNT接着力は、ニューロン-ニューロン凝集力と競合し、グリッドチャンバー内でのクラスター形成を遅らせたと考えられます。 対照的に、フラクタル ギャップ内のニューロンは VACNT エッジに遭遇する可能性が低く、その結果、細胞体がより大きなクラスターに集合する傾向が高くなります。 グリアの存在もこの凝集パターンを促進しました。 集約中に、より大きなクラスターを接続するプロセスが減少し、一部が結合してバンドルを形成し、これが NSi の減少に寄与しました。これは、プロセス検出アルゴリズムが通常、各バンドルをクラスター間の 1 つのリンクとしてカウントするためです (「材料と方法」セクションを参照)。 このクラスタリング動作により、フラクタル ギャップ内の多くの場所にプロセスが完全に空になったままになります。 したがって、この 2 番目の接着依存パターンの優位性が、グリッド チャンバーと比較してフラクタル ギャップの NSi 値が大幅に低いことを説明できる可能性があります (図 5c)。

以前の結果48、53と一致して、VACNT表面は、フラクタル電極とグリッド電極の両方でSiO2表面と比較してより大きなニューロンプロセスの成長をサポートしました（図3b、d）。 CNT のナノ粗さは、ECM 特性の一部を模倣しており、誘導されたニューロン プロセスの成長と優れたニューロン接着を実現します 41,42。 さらに、それらはニューロンプロセスの成長と分岐を改善できる好ましい機械的柔軟性を提供する87ので、それ以上の化学的表面修飾を必要とせずに、ニューロンの接着、生存、成長に適した環境を確立します48。 これにより、グリッド (図 3b) とフラクタル電極 (図 3d) の両方で、NCNT の値が NSi 値よりも大幅に大きくなりました。 地形的手がかりに対する感度31、33、88、89により、プロセスは両方の電極のVACNT側壁の上端と下端に従う傾向を示しました（図2i、j、補足図S4）。 両方の電極設計の接続されたエッジ長が大きいため、クラスターが形成され、VACNT 側壁に固定される機会が提供されました。 フラクタルと比較したときのグリッドの NCNT 値が大きいこと (図 5d) は、クラスターがグリッドの VACNT 側壁に固定され、チャンバー内のプロセスと VACNT 表面上のプロセスの間のより大きな接続が促進される可能性が高いことによって説明される可能性があります (図 5d)。 2oおよび補足図S4）。

ここで、GCNT がフラクタルよりもグリッドの方が高い理由を考えます。 2 つの電極の ACNT 値が類似しており、VACNT 表面が細胞の分裂と成長を妨げるため、これは不可解です 59。 これらの考慮事項に基づいて、GCNT は 2 つの電極で同様であると予想されます。 推測ではあるが、グリッドのニューロンが豊富な VACNT 表面は、環境中に存在する網膜前駆細胞の一部の運命をグリアになる方向に変えた可能性がある 90,91。 in vivo では、神経幹細胞/前駆細胞は、その環境に存在する物理的、生化学的、および地形的手がかりに応じて、さまざまな神経細胞タイプに分化する能力を持っていることが知られています 93、そしておそらくこの効果は、私たちの in vitro 環境にも拡張されていると思われます 62,94。 したがって、フラクタル上のグリッドの NCNT 値が大きくなる (図 5d) と、GCNT 値が大きくなる (図 5b) 可能性があります。 グリッドの VACNT 表面上のニューロンとグリアの間のこの関係は、図 6 によってさらに示唆されます。

グリッドおよびフラクタル電極における GCNT と NCNT の関係の研究。 グリッド (赤) とフラクタル (青) の GCNT と NCNT の散布図。

図 5a と図 5b に戻ると、フラクタルと比較したグリッドの GSi の小さい値と GCNT の大きい値が組み合わされて、図 3a の 2 つのパラメーター間に有意差が生じません。 対照的に、図 5a と図 5b の GSi の値が大きく、GCNT の値が小さいと、図 3c に見られるフラクタルの有意な差が生じます。 NCNTはグリッドとフラクタルの両方でNSiよりも大幅に大きいですが、その差はグリッドの方が大きくなります（図3b、d）。 これらの特性は図 4 でも見ることができます。図 4a ではフラクタル データがグリッド データよりも黒い線の上にあり、図 4b ではその逆が当てはまります。 図4bで観察されたNSiによるNCNTの増加は、VACNT側壁に固定されたクラスターがチャンバー内のニューロンとVACNT表面上のニューロン間のプロセスを介した接続を媒介するという上記の仮説と一致しています。

SiO2 表面にグリアを蓄積し、VACNT 表面にニューロンを蓄積するという根本的な目的に関して、前者ではフラクタル電極が、後者ではグリッド電極がより優れたパフォーマンスを発揮しました。 しかし、グリッド VACNT 表面上のニューロンの近くにグリアが相対的に不足しているため、長期的にはニューロンの生存と電気活動に悪影響を及ぼすことが予想されます。 今回の研究の目的は、個々のグリア細胞体のスケールでグリッド チャンバーを検討することでしたが、チャンバー サイズの増加の影響を考慮することは有益です。 より大きなグリッドが製造された場合、グリア表面被覆率にいくつかの有益な効果が得られる可能性があります。 しかしながら、より大きなチャンバーは、その形状の制限が少ないため、グリアをカバーするための物理的自由度が増加する可能性がありますが、それに伴い、VACNT への近接性が減少します。 これは複数の悪影響を及ぼします。(1) ニューロンとグリアは相互の化学的合図から恩恵を受け 83,84、両方の細胞タイプが近接すると増殖します。 より大きなチャンバーを備えたグリッドを実装すると、チャンバーの中央にあるグリアと VACNT 表面上のニューロンとの間の近接性が減少します。(2) チャンバーの中央にあるグリアは、より多くのニューロンを VACNT 側壁から引き離します。 これにより、チャンバーの中央にあるニューロンと側壁に固定されているニューロン（2 つの表面にわたる接続を仲介する）との間の距離が増加し、NCNT が減少する可能性があります。(3) チャンバーのサイズが非常に大きい場合、細胞のないギャップ領域が存在する可能性が増加します 59 (4) VACNT の空間密度が低下すると、ニューロンをサポートおよび刺激する表面の凹凸が少なくなります。 補足図S5は、フラクタル設計をさまざまなチャンバーサイズを特徴とするグリッドと比較し、2つの幾何学的パラメーターを計算して、2つの電極設計によって達成されるギャップの接続性とギャップの近接性の間の理論的なバランスを調査します。 今後の実験では、この初期モデリングに基づいて、さまざまなグリッド サイズにわたるフラクタルの好ましい特性を確認する必要があります。

フラクタル電極のギャップにおける優れたグリア被覆率を確立したので、次に、VACNT 電極上でニューロンを健康で機能的に保つために必要なグリアの量について議論します。 SiO2 ギャップ内のグリアと VACNT 電極上のニューロンの間の相関を研究するために、図 7 に NCNT 対 GSi をプロットしました。フラクタル設計を考慮すると、NCNT は GSi とともに増加し、R2 が 0.63 で表される線形フィットが示されています。 。 この適合は、厳密に線形の動作を暗示するためではなく、次の重要な観察結果を強調するために使用しています。 まず、データ傾向は、グリアの欠如 (つまり、GSi = 0) がニューロンプロセスの成長を大幅に妨げることを示唆しています。 しかし、データは明確な下限値 (つまり、NCNT がゼロになる GSi 値) を明らかにしていません。 これは、近くにグリアが存在しない場合でもプロセスをサポートするいくつかの VACNT 領域が存在することを示す定性的観察によって裏付けられています。 第二に、培養物内の GSi の変化によりグリアが増加すると、この存在の増加によりニューロンの成長が促進されます。 GSi がさらに増加すると、最終的に NCNT が飽和したり、枯渇を示したりする可能性があります 95,96 が、私たちの 17 DIV フラクタル システムは上限のない領域内で動作します。つまり、グリアが多いほど良いということです。 フラクタル電極内の変化を比較することにより、他のすべての幾何学的要因が一定であるため、ニューロンのプロセスの成長を健康の指標として捉えることができます。 この仮定を 2 つの電極形状間の比較に拡張することはできないことを強調します。 特に、フラクタルと比較してグリッドによって達成されるより高い NCNT 値は、グリッドのより大きな GCNT 値とともに、前述の幾何学的要因 (つまり、SiO2 領域と VACNT 領域にわたるより大きな接続を促進する側壁) から生じます。 完全を期すために、グリッドの線形近似を含めますが、グリッドの著しく低い GSi 値により、NCNT と GSi の間の関係に関する意味のある観察が除外されることに注意してください。

グリッドおよびフラクタル電極における NCNT と GSi の関係の研究。 グリッド (赤) とフラクタル (青) の NCNT と GSi の散布図。 赤の実線と青の実線は、それぞれグリッドとフラクタルのゼロを通るフィッティングです。

上記の議論は、より広範なシステムの絶対値を宣言するのではなく、私たちのシステムにとって有利なグリアの相対量に焦点を当てています。 これまでの研究では、細胞型の集団、およびその結果としてのニューロンとグリアの比率が、同じ哺乳動物種の系統間で、また同じ構造のサブ領域間でニューロン密度の関数として大きく異なる可能性があることが強調されています97。 グリアニューロン比についての現在の理解では、VACNT 電極上のニューロンの健康と生存を保証するためにギャップに必要なグリアの数の下限または上限を決定するのは困難です。 以前の研究では、ニューロンを死から守るためには最小限のグリア占有が必要であると主張されていましたが、必要な占有の程度は定量化されていませんでした95。 また、我々の in vitro システムで報告されているグリアの被覆率と細胞配置は、神経変性状態 15,81 またはインプラントの挿入 14,15 の影響を受けたグリア神経組織におけるグリアの被覆率と細胞分布とは大きく異なることも認めています。 適切なグリアとニューロンの比率をより深く理解するには、黄斑変性などの網膜変性の生体内モデルを使用する今後の実験が必要です。

最後に、グリッド電極とフラクタル電極の現在の研究を、これら 2 つの形状に関する以前の研究と比較します。 グリッドを始めとして、さまざまな地層がグリアの調査で取り上げられてきました。 先に議論した 1978 年の研究は、グリッド チャンバーとその周囲のコーティング領域との間の高さの差が無視できるほどであるにもかかわらず、グリア細胞を含まないグリッド チャンバーが実験中ずっとそのままであることを最初に実証しました 65。 私たちの研究のグリッド電極の壁は、1978 年の研究と比較してはるかに高くなりました。 これは、付着面および非付着面の制限的な役割と比較して、電極壁の強化された制限的な役割を強調します。 サイズ依存性に関しては、75 ～ 200 µm の範囲のチャンバー サイズを使用したグリッド アレイ内の表面積の増加に応じて、グリアの被覆率が増加することが研究で示されています98。 トレンチ６４によって画定されるグリッドパターンの場合、５００μｍの最大トレンチ間隔が最も高いグリア被覆率を提供した。 これらの発見は、グリアがより空間自由度の高い形状を好むことを強調しています。 たとえば、トレンチは、私たちの研究における接続されたギャップ、したがってそれらに蓄積されたグリアに相当すると考えることができます。 したがって、これらの発見は、グリア被覆を促進する身体的自由についての私たちの議論と一致しました。 他の研究では、無視できる高さのグリッドパターンとニューロンの相互作用を調査しました34,63。 これらは、ニューロンがパターンに従い、より長い培養でのみパターンから逸脱することを示しました。 私たちの研究の場合、電極の高さにより、ニューロンとそのプロセスをより強力に電極表面に長時間閉じ込めることができる可能性があります。 別の研究では、26 個の DIV 培養物において、海馬ニューロンとグリアが無視できるほどの高さで格子パターン上に共局在することが示されました 62。 この研究の目標は、2 種類の細胞を互いに近接させながら電極の異なる領域に誘導することを目的とする私たちの目標とは根本的に異なります。 ここで議論した以前の研究のほとんどは純粋なグリアまたはニューロンの培養に焦点を当てていましたが、私たちは生体内組織とより類似した条件でのそれらの挙動を観察するためにニューロンとグリアの共培養を調査しました。 これらの研究では、グリッド設計によって形作られていますが、細胞を目的の領域に誘導するために化学的アプローチが使用されています。 これらのアプローチは、生体内での応用には十分に安定していない可能性があり、ギャップが成長と細胞分裂を通じて細胞の適用範囲を拡大する可能性を提供するという現在の研究とは根本的に異なります。

同様に、「開いた」幾何学的形状の代表としてのフラクタル設計の選択は、以前の実験的注意に基づいています59。 現在の研究では、ギャップの接続性の「開いた」対「閉じた」側面に焦点を当てましたが、最近の補足的な研究では、フラクタル ギャップのマルチスケール特性を調べ、2 つの中心的なフラクタル パラメーター D と m を変化させました。 D を増加すると、ギャップの拡大速度が低下し、ニューロンが豊富な電極に近接しているため、ギャップが比較的小さくなり、グリアの被覆率が高くなります 59。 物理的に「開いている」にもかかわらず、m = 6 設計のフラクタルのギャップ幅はすべて、セルの拡張を制限するのに十分なほど狭かったです。 対照的に、m = 4 および 5 では、WSi-min 値が大きくなり「開いた」システムが形成されるため、グリアの被覆率は今回の研究で明らかになったレベルまで増加しました。 したがって、現在の研究では D = 2、m = 5 パラメータの採用が選択され、「閉じた」グリッドと比較するために「開いた」システムが確保されました。

この研究では、蛍光顕微鏡を使用して、17 DIVのin vitro環境で電極と相互作用するマウス網膜ニューロンおよびグリアの基本的な挙動を調査しました。 この研究は、グリア反応および関連するニューロンの挙動を制御するために、電極の形状と電極材料の特性を組み合わせることが重要であることを実証しました。 SiO2 基板上に VACNT を成長させることにより、テクスチャー (VACNT) 表面と滑らかな (SiO2) 表面の横方向にパターン化された領域を生成しました。 異なる表面テクスチャーに対する細胞応答に関する以前の研究に基づいて、滑らかな SiO2 領域は主にグリアを蓄積するために電極設計に導入され、テクスチャーのある VACNT 領域の役割はニューロンを蓄積することでした。 この戦略に従って、フラクタル設計で複数のスケールを持つ接続された SiO2 ギャップで構成される「開いた」システムは、グリッド内の切断されたギャップの配列を特徴とする「閉じた」システムと比較して、グリアの被覆を促進することを実証しました。 対照的に、グリッド電極は、VACNT 側壁にニューロンが近接している可能性があるため、VACNT 表面上にニューロンを蓄積する際に優れた性能を発揮しました。 しかし、グリッド VACNT 上のニューロンの近くにグリアが相対的に不足しているため、それらの生存と電気活動に悪影響を及ぼすことが予想されます 95。

今回の研究は、考えられるさまざまな形状を包括的に調査することを目的としたものではなく、2 つの例を比較することによって、将来の設計に役立ついくつかの基本的な動作を実証することを目的としていました。 「閉じた」システムと「開いた」システムの代表としてグリッド電極とフラクタル電極を選択したのは、アプリケーションと基本的な細胞挙動の両方の観点から、これらの形状に関する以前の研究に基づいています。 実験的な比較に基づいて、将来の電極設計には、ギャップの接続性と近接性のバランスを慎重に考慮する必要があります。 我々は、補足情報でこれらの効果を定量化するための 2 つの可能なパラメーターを提示し、フラクタルの接続性と比較的大きな近接性の組み合わせが、グリッドと比較して細胞の生存の可能性をどのように高めるかについて議論しました。

これらの結果に基づいて、電極と相互作用する組織内のさまざまな種類の細胞の陽性反応を最大化する、材料と形状の最適化された組み合わせが存在するという仮説を立てています。 例として、現在のフラクタル パターンは、分岐の削除または回転によって変更され、パターンを境界長方形に接続して連続電極を維持しながら、電極の中央ギャップ領域の障壁を除去できます。 このような戦略は、VACNT分岐への近接性をほぼ同じに保ちながら、グリアのSiO2ギャップの接続性とアクセスしやすさを高めます（補足図S6a、b）。 これらの前向きな変更とは対照的に、近接性を高めるためにフラクタル設計に追加の分岐を導入すると、特にジオメトリの接続性を低下させる閉じた SiO2 領域が作成されるなど、悪影響が生じる可能性があります (補足図 S6c)。 長期的には、この最適化を使用して、ニューロンの記録と刺激のための埋め込み型デバイスの効率を最大化することができます。

私たちの研究はグリアとニューロンの空間分布を制御する基本的な能力を実証しましたが、将来の実験ではニューロンの健康とその電気刺激の観点からの利点を確認する必要があります。 健康への影響を考慮すると、現在のフラクタル電極は、近くのグリアの存在の増加が電極上のニューロンプロセスの成長の促進と相関する領域内で動作し、ニューロンの健康に対する「グリアが多いほど良い」アプローチを示しています。 この運用体制は普遍的であるとは期待されておらず、システムによってはグリア蓄積の上限を特定し、定量化する必要がある可能性があることに注意を促します。 特に、私たちの in vitro 研究は in vivo 挙動の制御されたモデルを表していますが、これらの環境間の違いは長期的には調整する必要があります。 たとえば、生体内実験には、三次元構造的に無傷な神経組織との電極相互作用が含まれます。 グリアは、電極層（つまり、高さ 25 μm の電極間のギャップに蓄積）と電極上の網膜層に存在します。 実際には、埋め込まれた電極は、すでに反応性神経膠症の兆候を示しており、健康な組織と比較して再構築されている不健康な網膜組織と接触することに注目しています99,100。 したがって、電極上の三次元空間内の過剰なグリアは、ニューロンと電極の界面として機能する VACNT 表面から遠ざけるように誘導される必要があります。 グリアを電極の接続されたギャップに誘導すると、より多くのニューロンが電極の表面に引き寄せられます99。 電極ギャップ内のグリアと電極上の網膜層内のグリアの相対的な健康への寄与は、興味深い疑問を形成します。 しかし、将来の電極は、より高いアスペクト比の VACNT を使用することで、より三次元的な特性を持ち、電極が神経組織の奥深くまで浸透し、標的のニューロンに近づくことができるようになると予想されています。 界面層は、これらの将来の電極設計においてますます重要な役割を果たすことになります。

電気刺激を考慮すると、これまでの研究により、材料システムとしての CNT の高い可能性が実証されています。 パターン化されていない CNT とパターン化された CNT はどちらも電気的にバイアスされて、刺激 50,101、記録 51,102、さらにはニューロン内の電気信号伝達を増強する 51,103 こともあります。 ただし、これらの以前の研究では、細胞配置の影響は調査されていませんでした。 今後の研究では、以前の研究で強調された好ましい刺激特性が、我々の研究で提示された細胞のネットワークの配置を通じてどの程度強化できるかを調査する必要があるでしょう。 ここでは、細胞の全体的な配置を調査するために大規模な電極を使用しました。 それらを脳または網膜刺激インプラントに変換するには、より高い解像度に対応する必要があるため、ここではいくつかの潜在的なアプローチを検討します（補足図S7）。 最も単純な変換は、活性電極の通過を可能にするギャップを特徴とする長方形の接地電極によって境界付けられた活性電極としてフラクタル電極を使用することであろう。 ただし、アクティブ電極は、典型的な脳インプラントのサイズに合わせて縮小するか、コンポーネント電極に細分化する必要があります。 網膜インプラントに適用できる、より魅力的なアプローチは、枝に沿って小さな穴の配列が定義された大規模なフラクタルを接地電極として使用することです。 各穴は、絶縁体によって接地電極から分離されたフォトダイオード層上に堆積されたアクティブな正方形の電極をカプセル化します (このフォトダイオードの動作のシミュレーションについては参考文献 56、57 を参照)。 将来の研究は、プロセスの成長を潜在的に促進し、電気容量を増加させ、したがってニューロンを刺激する能力を増加させるために、正方形のアクティブ電極をフラクタル電極に置き換えることに焦点を当てます57、58。 このアプローチでは、グリアを収容するための SiO2 ギャップが犠牲になり、活性電極の高密度アレイが得られなくなります。 ただし、より健全なニューロンと電極のインターフェースが確保されます。 今回の研究で示された一般原理が生体内インプラントに拡張される場合、多数のニューロンが電極の刺激場内に存在し、近くのグリアによって提供されるニューロンの長期的な健康状態が動作の安定性をもたらすことが保証される。

すべてのデータと関連コードは、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20044022 で入手できます。

Jang、J.ら。 失明回復のための電子視覚補綴物の移植。 オプション。 メーター。 Express OME 9、3878 ～ 3894 (2019)。

記事 ADS Google Scholar

Chenais, NAL、Airagi Leccardi, MJI & Ghezzi, D. 太陽光発電網膜補綴物は、盲目の網膜の単一ピクセル刺激に対する高解像度の応答を回復します。 共通。 メーター。 2、1–16 (2021)。

記事 Google Scholar

プレヴォ、P.-H. 他。 ヒト以外の霊長類に移植された光起電力網膜下プロテーゼに対する行動反応。 ナット。 バイオメッド。 工学 4、172–180 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Tong, W.、Meffin, H.、Garrett, DJ & Ibbotson, MR 人工網膜の解像度を向上させるための刺激戦略。 フロント。 神経科学。 14、262 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ロラック、H. et al. 光起電力により高い視力を回復します。 ナット。 医学。 21、476–482 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palanker, D.、Mer、YL、Mohand-Said、S.、Muqit、M. & Sahel、JA 萎縮性加齢黄斑変性症における中心視力の光起電力修復。 眼科学 127、1097–1104 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Palanker, D.、Le Mer, Y.、Mohand-Said, S. & Sahel, JA AMD 患者における補綴視覚と自然視覚の同時知覚。 ナット。 共通。 13, 513 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan, X. & Agid, Y. グリアの歴史の起源。 神経科学 385、255–271 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Von Barthold, CS、Bahney, J. & Herculano-Houzel, S. 人間の脳におけるニューロンとグリア細胞の真の数の探索: 150 年にわたる細胞計数のレビュー。 J.コンプ。 ニューロール。 524、3865–3895 (2016)。

記事 Google Scholar

Zhang, Y. & Barres, BA 星状細胞の不均一性: 神経生物学において過小評価されているトピック。 カー。 意見。 ニューロビオール。 20、588–594 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アカロン レデスマ、H. 他ナノ対応のニューラル インターフェイスのアトラス。 国立ナノテクノロジー。 14、645–657 (2019)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Buffo, A.、Rolando, C. & Ceruti, S. 損傷した脳のアストロサイト: それらの反応性反応と治癒の可能性についての分子的および細胞的洞察。 生化学。 薬理学。 79、77–89 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウェルマン、SMら。 機能的なニューラル インターフェイス設計への材料ロードマップ。 上級機能。 メーター。 28、1701269 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

ターナー、JN et al. 微細加工されたシリコンインプラントに対する大脳アストロサイトの反応。 経験値ニューロール。 156、33–49 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

de Hoz、R. et al. 健康と病気における網膜マクログリア反応。 バイオメッド。 解像度内部。 2016、2954721 (2016)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Nguyen-Vu、TDB 他多機能 3-D 神経電気インターフェースとしての垂直に整列したカーボン ナノファイバー アーキテクチャ。 IEEEトランス。 バイオメッド。 工学 54、1121–1128 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

モシャエディ、P.ら。 中枢神経系におけるグリア細胞の機械過敏性と異物反応との関係。 バイオマテリアル 35、3919–3925 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Salatino, JW、Ludwig, KA、Kozai, TDY & Purcell, EK 脳に埋め込まれた電極に対するグリア反応。 ナット。 バイオメッド。 工学 1、862–877 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

メイン州ハッテンおよびカリフォルニア州メイソン in vitro および in vivo でのグリア誘導ニューロン移動のメカニズム。 細胞。 モル。 生命科学。 46、907–916 (1990)。

記事 CAS Google Scholar

Norris, CR & Kalil, K. 発達中の大脳皮質における放射状グリアによる脳梁軸索の誘導。 J. Neurosci. 11、3481–3492 (1991)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singer, M.、Nordlander, RH & Egar, M. イモリの脊髄における胚形成と再生中の軸索誘導: ニューロン経路パターン形成の青写真仮説。 J.コンプ。 ニューロール。 185、1–21 (1979)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tsui, C.、Koss, K.、MA チャーチワード & Todd, KG 生体材料とグリア: 神経炎症を調節する設計の進歩。 アクタバイオメーター。 83、13–28 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dyer, MA & Cepko, CL 網膜損傷後のミュラーグリア細胞の増殖と活性化の制御。 ナット。 神経科学。 3、873–880 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pfrieger、FW および Barres、BA インビトロでのグリア細胞によってシナプスの有効性が強化されました。 サイエンス 277、1684–1687 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Thelin、J.ら。 インプラントのサイズと固定モードは、CNS の組織反応に大きな影響を与えます。 PLoS ONE 6、e16267 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

モクソン、KA et al. セラミックベースの微小電極のナノ構造表面修飾により、脳と機械の直接的なインターフェースの生体適合性が向上します。 IEEEトランス。 バイオメッド。 工学 51、881–889 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

Craighead, HG et al. 中枢神経系の細胞接着を制御するための化学的および地形的表面修飾。 バイオメッド。 マイクロデバイス 1、49–64 (1998)。

記事 CAS Google Scholar

アマニ、H.ら。 生体材料表面の設計による細胞の挙動の制御: 表面改質技術に焦点を当てます。 上級メーター。 インターフェイス 6、1900572 (2019)。

記事 Google Scholar

Khan, S. & Newaz, G. 神経細胞の接着とパターン形成のための表面修飾に関する包括的なレビュー。 Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． メーター。 解像度パート A 93A、1209–1224 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Belkaid、W. et al. 微細パターン化された成長促進および阻害基質に対する細胞の応答。 BMCバイオテクノロジー。 13、86 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ピレット、G.、ペレス、M.-T. & Prinz, CN 垂直ナノワイヤアレイによるグリア成長よりもニューロン成長のサポートと視神経軸索の誘導。 ACS アプリケーションメーター。 インターフェイス 7、18944 ～ 18948 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zuidema, JM、Gilbert, RJ & Gottipati, MK バイオマテリアルは、反応性アストログリア反応を調節するアプローチをとります。 CTO 205、372–395 (2018)。

PubMed Google Scholar

Moslehi, S.、Watterson, WJ、Rowland, C.、Smith, JH & Taylor, RP ジグザグ表面パターンを使用した培養網膜ニューロンの物理的誘導。 午前。 Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． 科学。 解像度 11、219–221 (2020)。

記事 Google Scholar

Xu、X.ら。 パターン化された組換えヒト IgM は、CNS ニューロンの神経突起伸長を誘導します。 科学。 議員 3、1–9 (2013)。

記事 Google Scholar

セント・ジョン首相ほかマイクロコンタクト印刷された表面へのグリア細胞の優先的な付着。 J. Neurosci. 方法 75、171–177 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤン、IH、Co、CC & Ho、C.-C. ニューロンとグリア細胞の空間制御された共培養。 Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． メーター。 解像度パート A 75A、976–984 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

ファン、YW 他ナノスケールの表面トポグラフィーを備えたシリコンウェーハ上での神経細胞の培養。 J. Neurosci. 方法 120、17 ～ 23 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Xie、C.ら。 ナノピラーアレイによる非侵襲的なニューロンピンニング。 ナノレット。 10、4020–4024 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zamani, F.、Amani-Tehran, M.、Latifi, M. & Shokrgozar, MA エレクトロスピニングされた PLGA ナノ繊維足場の表面ナノ粗さが神経細胞の接着と増殖に及ぼす影響。 J. メーター。 科学。 メーター。 医学。 24、1551–1560 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Blumenthal, NR、Hermanson, O.、Heimrich, B. & Shastri, VP 確率的ナノ粗さは、機械感知陽イオンチャネルを介してニューロンとアストロサイトの相互作用と機能を調節します。 PNAS 111、16124–16129 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, H.、Ni, Y.、Montana, V.、Haddon, RC & Parpura, V. ニューロン成長の基質として化学的に官能化されたカーボン ナノチューブ。 ナノレット。 4、507–511 (2004)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nick, C.、Yadav, S.、Joshi, R.、Thielemann, C. & Schneider, JJ ランダムに配向され垂直に整列した高密度カーボン ナノチューブ ネットワーク上の皮質ニューロンの成長と構造識別。 バイルシュタイン J. ナノテクノロジー。 5、1575–1579 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

チャップマン、CAR et al. 神経界面コーティングとしてのナノ多孔質金: トポグラフィー、表面化学、およびフィーチャーサイズの影響。 ACS アプリケーションメーター。 インターフェイス 7、7093 ～ 7100 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Georges, PC、Miller, WJ、Meaney, DF、Sawyer, ES & Janmey, PA 脳組織のコンプライアンスに匹敵するコンプライアンスを持つマトリックスは、混合皮質培養物においてグリアよりもニューロンの成長を選択します。 生物物理学。 J. 90、3012–3018 (2006)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chapman, CAR、Chen, H.、Stamou, M.、Lein, PJ & Seker, E. ナノ多孔質金表面上の皮質ニューロン - グリア共培養におけるアストロサイト表面被覆率の減少のメカニズム。 セル。 モル。 バイオエンジ。 9、433–442 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

イアンナコウ、C.ら。 レーザーによるマイクロ/ナノ構造のシリコン表面によるセルのパターニング。 バイオファブリケーション 9、025024 (2017)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Ereifej、ES et al. アストロサイトの反応性に対するナノパターニングの影響。 Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． メーター。 解像度パート A 101A、1743 ～ 1757 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ワッターソン、WJら。 網膜ニューロンとのインターフェースにおける垂直配向カーボンナノチューブの生体適合性および機械的完全性におけるアルミニウム下層の役割。 マイクロマシンズ (バーゼル) 11, 546 (2020)。

記事 Google Scholar

McKenzie, JL、Waid, MC、Shi, R. & Webster, TJ カーボンナノファイバー材料上のアストロサイトの機能の低下。 バイオマテリアル 25、1309–1317 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, K.、Fishman, HA、Dai, H. & Harris, JS カーボン ナノチューブ微小電極アレイによる神経刺激。 ナノレット。 6、2043 ～ 2048 年 (2006)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Cellot、G.ら。 カーボンナノチューブは電気的ショートカットを促進することでニューロンのパフォーマンスを向上させる可能性があります。 ナット。 ナノテクノロジー。 4、126–133 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Bareket、L. et al. 盲目の網膜をワイヤーフリーで光刺激するための半導体ナノロッド - カーボン ナノチューブ生体模倣フィルム。 ナノレット。 14、6685–6692 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bareket-Keren, L. & Hanein, Y. ニューロンインターフェース用のカーボンナノチューブベースのマルチ電極アレイ：進歩と展望。 フロント。 神経回路 6、122 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Fabbro, A.、Bosi, S.、Ballerini, L.、Prato, M. カーボン ナノチューブ: 単一ニューロンおよびニューロン ネットワークを操作するための人工ナノマテリアル。 ACS Chem. 神経科学。 3、611–618 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Voge, CM & Stegemann, J. 神経インターフェース用途におけるカーボン ナノチューブ。 J. Neural Eng. 8、011001 (2011)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

パンパローニ、NP 他。 2D ナノ構造インターフェースによるシナプス発達中の神経伝達の彫刻。 ナノメッド。 ナノテクノロジー。 バイオル。 医学。 14、2521–2532 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Watterson, WJ、Montgomery, RD & Taylor, RP ニューロンを刺激するための汎用インターフェースとしてのフラクタル電極。 科学。 議員 7、1–9 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Watterson, WJ、Montgomery, RD & Taylor, RP フラクタル電極を備えたフォトダイオードベースの網膜インプラントを使用して、視力の向上をモデル化しています。 フロント。 神経科学。 12、277 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Moslehi, S. et al. フラクタル電極およびユークリッド電極上での網膜細胞の集合の制御。 PLoS ONE 17、e0265685 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゴレスタニラド、L.ら。 効率的な神経刺激のためのフラクタル電極の解析。 フロント。 ニューロエング。 6、1–10 (2013)。

記事 Google Scholar

Krukiewicz, K. et al. 薄膜神経インターフェース材料としてのフラクタル形式の PEDOT/Au アセンブリ。 バイオメッド。 メーター。 13、054102 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Nam, Y.、Brewer, GJ & Wheeler, BC パターン化された神経細胞培養におけるアストログリア細胞の開発。 Ｊ．バイオメーター。 科学。 ポリム。 エド。 18、1091–1100 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マルコーニ、E. et al. 制御されたトポロジーを持つニューロンネットワークの創発的な機能特性。 PLoS ONE 7、e34648 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジョーダン医師らパリレン C が埋め込まれた SiO2 トレンチにパターン化されたヒト星状細胞グリッド ネットワーク。 バイオマテリアル 105、117–126 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Westermark, B. ヒトグリア細胞のミニクローンにおける増殖制御。 経験値セル解像度 111、295–299 (1978)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mandelbrot, B. & Pignoni, R. 自然のフラクタル幾何学 Vol. 173 (WH フリーマン、1983)。

Google スカラー

Bassingthwaighte、JB、Liebovitch、LS & West、BJ フラクタル生理学 (Springer、1994)。

Google Scholar を予約する

Iannaccone, PM および Khokha, M. 生物システムにおけるフラクタル幾何学: 分析的アプローチ (CRC Press、1996)。

Google スカラー

West、GB、Brown、JH & Enquist、BJ 生命の 4 次元: フラクタル幾何学と生物のアロメトリック スケーリング。 サイエンス 284、1677–1679 (1999)。

論文 ADS MathSciNet CAS PubMed MATH Google Scholar

Banavar, JR、Maritan, A.、Rinaldo, A. 効率的な交通ネットワークの規模と形態。 Nature 399、130–132 (1999)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

レノン、FE 他。 肺がん - フラクタルの視点。 ナット。 クリン牧師。 オンコル。 12、664–675 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

スミス、JHら。 ニューロンがフラクタル幾何学を利用してネットワーク接続を最適化する方法。 科学。 議員第 11 号、2332 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seidel、D. et al. 樹木の構造の複雑さの尺度が、建築上の利益対コストの比率、光の利用可能性、樹木の成長にどのように関係するか。 エコル。 進化。 9、7134–7142 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hou, C.、Gheorghiu, S.、Huxley, VH & Pfeifer, P. 肺における酸素輸送のリバース エンジニアリング: 空間充填ネットワークによる需要とリソースの変化への適応。 PLOS コンピューティング。 バイオル。 6、e1000902 (2010)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ピレット、G.、ペレス、M.-T. & Prinz, CN 長期網膜細胞培養における GaP ナノワイヤー アレイ上の出生後 CNS ニューロンの神経突起伸長とシナプトフィジン発現。 バイオマテリアル 34、875–887 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zalis, MC、Johansson, S. & Englund-Johansson, U. 培養マウス初代網膜細胞の免疫細胞化学的プロファイリング。 Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． サイトケム。 65、223–239 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シャルマ、RK およびネットランド、ペンシルバニア州 網膜ニューロンの初期に生まれた系統は、クラス III β-チューブリン アイソタイプを発現します。 脳解像度 1176、11–17 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Harrill, JA、Robinette, BL、Freudenrich, T. & Mundy, WR ハイコンテンツ画像解析を使用して、ラットの初代皮質ニューロンの神経突起亜集団に対する化学媒介効果を検出します。 神経毒性学 34、61–73 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラジオ、ニューメキシコ州およびマンディ、WR インビトロでの発生神経毒性試験: 神経突起伸長に対する化学的影響を評価するためのモデル。 神経毒性学 29、361–376 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブリングマン、A.ら。 健康な網膜と病気の網膜のミュラー細胞。 プログレ。 レチン。 目の検査 25、397–424 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vecino, E.、Rodriguez, FD、Ruzafa, N.、Pereiro, X.、Sharma, SC 哺乳類の網膜におけるグリアニューロン相互作用。 プログレ。 レチン。 目の検査 51、1–40 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Shi、M.ら。 マイクロ流体プラットフォームにおけるグリアとニューロンの共培養は、シナプス接触の形成と安定化を促進します。 ラボチップ 13、3008–3021 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オッペンハイム、RW 神経系の発達中の細胞死。 アンヌ。 神経科学牧師。 14、453–501 (1991)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fields, RD & Stevens-Graham, B. ニューロンとグリアのコミュニケーションに関する新たな洞察。 サイエンス 298、556–562 (2002)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaum, E. 成長因子による網膜神経保護: メカニズムの観点。 Ｊ．Ｃｅｌｌ． 生化学。 88、57–75 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Scott-Solomon, E.、Boehm, E.、Kuruvilla, R. 発達と病気における交感神経系。 ナット。 神経科学牧師。 22、685–702 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ボシ、S.ら。 ニューロンをインターフェースするためのカーボンベースの基板: 培養されたニューロンネットワークに及ぼす影響を元のカーボンナノチューブと官能化されたカーボンナノチューブとの比較。 カーボン 97、87–91 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

SW ムーア & シート MP 基質相互作用の生物物理学: 神経の運動性、分化、修復への影響。 開発者ニューロビオール。 71、1090–1101 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ニューメキシコ州ダウェル・メスフィンら。 地形的に変化した表面は、海馬ニューロンの配向と成長に影響を与えます。 J. Neural Eng. 1、78–90 (2004)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

チェン、Ｘら。 出生後のマウスと成体のマウスにおける網膜前駆細胞の証拠。 幹細胞研究所 23、20–32 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Bassett, EA & Wallace, VA 脊椎動物の網膜における細胞運命の決定。 トレンド神経科学。 35、565–573 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ming, G. & Song, H. 哺乳類の中枢神経系における成人の神経新生。 アンヌ。 神経科学牧師。 28、223–250 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クリストファーソン、GT、ソング、H. & マオ、H.-Q. エレクトロスピニングされた基板の繊維径が神経幹細胞の分化と増殖に及ぼす影響。 バイオマテリアル 30、556–564 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chang, JC、Brewer, GJ & Wheeler, BC ニューロンネットワークの構造化は、アストログリアの発達の強化を通じてより大きなニューロン活動を誘導します。 J. Neural Eng. 3、217–226 (2006)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

ラミレス、AI 他実験的緑内障の同側および対側のラット網膜の大膠細胞における異なるレベルのIOPの影響の定量化。 調査します。 眼科。 ヴィス。 科学。 51、5690–5696 (2010)。

記事 Google Scholar

ブリングマン、A.ら。 ミュラー細胞神経膠症に関与する細胞シグナル伝達と因子: 神経保護作用と有害な作用。 プログレ。 レチン。 目の検査 28、423–451 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Keeley, PW、Patel, SS & Reese, BE マウス網膜の桿体経路における細胞数、細胞比率、および発生可塑性。 J.アナト。 https://doi.org/10.1111/joa.13653 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

ラオス、BJ 他アストロサイトネットワークにおけるCa2+動態の研究のための、パリレン-C/SiO2基板上への機能的なヒトアストロサイトのパターン化。 J. Neural Eng. 15、036015 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Butterwick、A. et al. 網膜との統合に対する網膜下人工装具の形状とコーティングの影響。 経験値目の検査 88、22–29 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジョージア州ゲッツ氏とDV エレクトロニック社による視力回復へのアプローチ。 プログレ議員。 物理学。 79、096701 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マッツァテンタ、A.ら。 ニューロンとカーボンナノチューブのインターフェース: 培養脳回路における電気信号伝達とシナプス刺激。 J. Neurosci. 27、6931–6936 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gabay, T. et al. カーボンナノチューブベースの多電極アレイの電気化学的および生物学的特性。 ナノテクノロジー 18、035201 (2007)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

ロバット、V. et al. カーボン ナノチューブ基板はニューロンの電気信号伝達を強化します。 ナノレット。 5、1107–1110 (2005)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

蛍光顕微鏡イメージング システムの機会とトレーニングを提供してくださった M. Pluth (オレゴン大学) に感謝します。 顕微鏡装置は NSF (CHE_1531189) によってサポートされました。 また、CVD システムの構築と VACNT 合成プロセスの開発に貢献した D. Miller と K. Zappitelli (オレゴン大学) にも感謝します。

RPT、CMN、BJA: WM Keck Foundation。 オレゴン大学。 RPT、WJW、MTP: プフェンドルフ研究所。 RPT: リビング・レガシー財団。 チミネリ財団。 科学の進歩のための研究評議会。 MTP: スウェーデン研究評議会—# 2016-03757; ルンド大学のNanoLund。 Synskadade と Malmöhus Län の Stiftelsen。 マルガレータ皇太子の盲人委員会。 クラフォード財団。 BJA: 国立科学財団 - # DMR-1532225; MJ マードック慈善信託。

物理学科、1371 オレゴン大学、ユージーン、オレゴン州、97403、米国

サバ・モスレヒ、コナー・ローランド、ジュリアン・H・スミス、ウィリアム・J・ワターソン、ベンジャミン・J・ジャーマン、リチャード・P・テイラー

材料科学研究所、1252 オレゴン大学、ユージーン、オレゴン州、97403、米国

サバ・モスレヒ、コナー・ローランド、ジュリアン・H・スミス、ウィリアム・J・ワターソン、ベンジャミン・J・ジャーマン、リチャード・P・テイラー

生物学部、1210 オレゴン大学、ユージーン、オレゴン州、97403、米国

ウィレム・グリフィス & クリストファー・M・ニール

神経科学研究所、1254 オレゴン大学、ユージーン、オレゴン州、97403、米国

クリストファー・M・ニール

オレゴン光学・分子・量子科学センター、1274 オレゴン大学、ユージーン、オレゴン州、97403、米国

ベンジャミン・J・アレマン

科学的影響を加速するフィルとペニー・ナイトのキャンパス、オレゴン大学 1505、Franklin Blvd.、ユージーン、オレゴン州、97403、米国

ベンジャミン・J・ジャーマン＆リチャード・P・テイラー

ルンド大学臨床科学部眼科、ルンド大学、221 84、ルンド、スウェーデン

マリア・テレザ・ペレス

NanoLund、ルンド大学、221 00、ルンド、スウェーデン

マリア・テレザ・ペレス

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著者全員が研究デザインに参加しました。 SM、CR、JHS、および WJW は、ニューロンおよびグリアの解析アルゴリズムを作成しました。 SM、WJW、および BJA は VACNT 合成プロセスを開発しました。 BJA は VACNT プラットフォームを考案し、実装しました。 SM および CR は VACNT 電極を製造し、MTP は細胞培養および免疫細胞化学プロトコルを開発しました。 SM、CR、および JHS は網膜細胞培養と蛍光顕微鏡検査を実施しました。 SM、CR、JHS、WGは画像処理を実施し、SMは統計データ解析を実施した。 SM、CR、RPT はデータ分析と検証を実行しました。 SM、CR、RPT がフィギュアをデザインしました。 SM、CR、RPT は図の編集を支援しました。 SM と RPT が原稿を起草しました。 RPT がプロジェクトを調整しました。 著者全員が原稿を編集しました。

リチャード・P・テイラーへの往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Moslehi、S.、Rowland、C.、Smith、JH 他。 解離した網膜ニューロンおよびグリアの挙動に対する空間的閉じ込めの影響を研究するためのフラクタル電極とグリッド電極の比較。 Sci Rep 12、17513 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21742-y

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公開日: 2022 年 10 月 20 日

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