細胞および生体内における活性酸素種および酸化的損傷を測定するためのガイドライン

Metabolismo della natura, volume 4,

Nature Metabolism volume 4、pages 651–662 (2022)この記事を引用

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活性酸素種 (ROS) の複数の役割と、それらが健康と病気に及ぼす影響が、生物科学全体で明らかになりつつあります。この開発により、ROS とその反応の複雑さに慣れていない研究者が、ROS と酸化損傷を測定するために市販のキットやプローブを不適切に使用し、ROS (一般的な略語) を別個の分子実体であるかのように扱っています。残念ながら、これらの測定値の適用と解釈には課題と制限が伴います。このことは、個々の ROS、その反応、シグナル伝達分子としての役割、およびそれらが引き起こす可能性のある酸化的損傷を評価する最善の方法について十分に確立された知識体系があるにもかかわらず、誤解を招く主張が文献に入り込み、進歩を妨げる可能性があります。このコンセンサスステートメントでは、ROS および酸化損傷の測定に一般的に使用される多くのアプローチで発生する可能性のある問題を明らかにし、ベストプラクティスのガイドラインを提案します。これらの戦略が、細胞内および生体内での ROS、酸化損傷、酸化還元シグナル伝達の評価を必要とする研究に役立つことを願っています。

活性酸素種 (ROS) (ボックス 1) は酸化還元シグナル伝達に密接に関与していますが、状況によっては酸化損傷を引き起こす可能性もあります。したがって、それらは生物学において生理学的役割と病態生理学的役割の両方を持っています1、2、3、4。その結果、さまざまな分野の研究者は、多くの場合、ROS を測定し、酸化現象を評価し、観察された現象を調節するために抗酸化剤 (ボックス 1) または阻害剤を使用してその生物学的重要性を調査する必要があります。利用可能なアッセイや市販のキットは数多くありますが、その使用と解釈は困難であり、アーチファクトが発生しやすいものです。 ROS、その化学反応、酸化損傷生成物の同定に焦点を当てた生物物理学/生化学/化学の十分に確立された分野があります。ただし、多くの専門分野と同様に、この文献は、その分野外で研究している人にとっては解釈が難しい場合があります。進歩のために特定の分子機構の理解が必要な場合、「ROS」または「酸化損傷」を測定すると主張する市販のキットへの依存、または一般的な用語での「抗酸化剤」の使用により、問題が頻繁に発生します。

これらの点に対処するために、この国際グループは、ROS、酸化反応、酸化損傷の命名法と測定に関するガイドラインを定めました。私たちは、ROS と酸化損傷の測定に使用される技術に焦点を当てています。これらは病理学における役割に適用できますが、ROS レベルの変化と、それに伴う酸化還元感受性細胞プロセスの活性の変化が酸化還元シグナル伝達の分野の中心であることに注意することも重要です 1,2,3,4 。このガイドラインが、この分野で実験を行う研究者にとって役立つことを願っています。これらのトピック、そして実際に私たちが提唱するアプローチは、過去の多くのレビューで取り上げられており、研究者はこれらを読むことを強くお勧めします。ここでは、この合意声明の基礎となる重要なポイントを抽出します。

活性酸素種 (ROS) は、O2 自体よりも反応性の高い O2 に由来する種の総称です。この用語には、スーパーオキシドラジカルアニオン (O2・-) やその他の酸素ラジカルだけでなく、過酸化水素 (H2O2)、次亜塩素酸 (HOCl)、ペルオキシ亜硝酸/ペルオキシ亜硝酸 (ONOO-) などの O2 の非ラジカル誘導体も含まれます。 /オノオ）。したがって、すべての酸素ラジカルは ROS ですが、すべての ROS がラジカル種であるわけではありません (後者は 1 つ以上の不対電子を持つ種として定義されます)。「反応性」は相対的な用語です。 O2・- と H2O2 は生体分子との反応において選択的であり、ほとんどの分子は無傷のままですが、・OH はすべてを攻撃します (表 1)。

抗酸化物質はよく使われる用語ですが、明確に定義するのは困難です。

ROS が生体内で生成されると、多くの抗酸化物質が作用します。それらの相対的な重要性は以下によって決まります。

どの ROS がどのくらいの量、どのような期間で生成されるか

どこでどのように生成されるか

ROSによる被害の対象を測定する

抗酸化物質の定義の 1 つは、「標的分子に対する酸化的損傷を遅らせ、防止し、または取り除く物質」です1。普遍的な「最良の」抗酸化物質は存在しません。異なる抗酸化物質はさまざまな速度で異なる ROS と反応し、さまざまな場所で作用し、さまざまな分子標的を保護します。別の定義は、「酸化剤と反応して他の標的との反応を調節し、酸化還元依存性の生物学的シグナル伝達経路および/または酸化的損傷に影響を与える物質」です。

酸化的損傷: 生物の構成要素に対する ROS の攻撃によって引き起こされる生体分子の損傷。酸化損傷レベルの増加は、ROS 産生の増加によって発生する可能性がありますが、修復または除去プロセスの減少によっても発生します。たとえば、酸化タンパク質の除去や酸化 DNA の十分な迅速な修復が失敗した場合、両方とも特定の疾患で発生する可能性があります。

バイオマーカー: 体内またはその製品内で測定でき、転帰や疾患の発生率に影響を与えたり、予測したりできる任意の物質、構造、またはプロセスとして定義できます54。

ROS と酸化損傷の測定、および「抗酸化剤」の使用の根底にある問題の 1 つは、これらの用語の使用が正確ではないことです。 ROS は、さまざまな特性、反応性、相互作用を持つ広範囲の化学種をカバーする略語です (囲み 1、表 1)。たとえば、生物学で見られる重要な反応種の 1 つであるスーパーオキシドラジカルアニオン (O2・-) は、酸素 (O2) の一電子還元によって形成されます。 O2•- 自体は、別のラジカル一酸化窒素 (•NO) と反応してペルオキシ亜硝酸塩を形成する 11、またはタンパク質内の Fe-S クラスターと反応する場合を除いて、あまり反応性がありません 12。同様に、さまざまなオキシダーゼ酵素 1,4 やスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) の作用によって生成される過酸化水素 (H2O2) は反応性が低いため、生体内で重要なシグナル伝達分子として使用できます 2,4。それにもかかわらず、第一鉄または第一銅イオンの存在下では、H2O2 はフェントン化学により非常に反応性の高いヒドロキシルラジカル (•OH) を形成します。 •OH は、近くの生体分子と非特異的かつ本質的に瞬時に反応します (表 1)1,13。フェントン化学を触媒する遷移金属イオンの利用可能性は生体内で慎重に制御されています1が、組織損傷やFe-Sクラスターを持つ特定のタンパク質がO2•-に遭遇すると、遷移金属イオンが放出される可能性があります（参考文献1、12、14）。 in vivo でのそれらの重要性は、「触媒」鉄イオンが関与する細胞死の一形態であるフェロトーシスに関する文献の増加によって最近強調されています 15。 H2O2 はミエロペルオキシダーゼなどのヘムペルオキシダーゼの基質であり、HOCl などのさらなる反応種を生成します (表 1)。全体的な反応性が低いにもかかわらず、H2O2 は特定のタンパク質の一部のメチオニン (Met) およびシステイン (Cys) 残基を選択的に酸化できます 16、17。

生物学で遭遇する最も一般的な ROS の物理化学的特性の (完全とは程遠い) リストを表 1 に示します。これは、これらの種が生成されるときに生体内でどのような反応が起こり得るかについての洞察を提供します。また、明らかにすべきことは、異なる ROS の反応性は、その寿命、拡散能力、さらに下流の反応性種を生成する可能性と同様に、広範囲にわたって変化するため、「反応性」は状況に大きく依存するということです。つまり、すべての ROS が同じというわけではありません。「ROS」という一般化は広く使用されていますが（この論文も含めて！）、観察された影響を引き起こす実際の化学種に関する情報は得られません。推奨事項 1: 可能な限り、生物学的プロセスに関与する実際の化学種を記載し、観察された効果がその反応性、寿命、生成される生成物、および生体内での運命と一致するかどうかを考慮する必要があります。それが不可能な場合は、「ROS」という用語の使用に関する注意事項について議論する必要があります。

生物学には広範囲の抗酸化物質が存在します。これらには、個々の ROS と反応して酸化損傷を軽減したり酸化還元シグナル伝達を調節したりする酵素や小分子が含まれます 1,2。「ROS」と同様に、一般用語として「抗酸化物質」を使用することは不正確で誤解を招く可能性があります (ボックス 1)。多くの場合、生物学的結果に対する推定上の抗酸化物質の効果は、あたかもすべての抗酸化物質が同等であるかのように、ROS の役割を推測するために使用されます。ただし、各抗酸化物質には独自の化学的性質と、異なる ROS との反応性があります。さらに、生体内での主要な抗酸化物質は、O2・- の SOD、H2O2 のペルオキシダーゼ、および金属イオンの隔離などの酵素系です。「抗酸化剤」として一般的に使用されるほとんどの低分子量化合物は、特定の ROS の化学量論的スカベンジャーであり、多くの場合、O2・- または H2O2 との反応性は (あるとしても) わずかです。たとえば、N-アセチルシステイン (NAC) は広く使用されている「抗酸化物質」ですが、他の (そして場合によってはより重要な) 作用機序を持っています。 NAC は確かに in vitro で一部の ROS を除去できますが、その他、特に H2O2 は除去できません (参考文献 18)。また、細胞の Cys プールを増加させ、それによってグルタチオン (GSH) レベルを高め、H2S を生成し、タンパク質ジスルフィドを直接切断することもできます 18。生体内で抗酸化物質として機能する低分子量化合物には、脂質ペルオキシルラジカルを除去するビタミン E が含まれます 19。この ROS の役割を推論するために「・OH スカベンジャー」が使用されることもありますが、・OH と生体分子の効果的な即時反応を防ぐのに十分な高濃度を達成できることは、たとえあったとしてもめったにありません 1,7,13。したがって、「抗酸化物質」、特に NAC に割り当てられる生物学的効果の多くは、他の効果によるものです。 TEMPO/TEMPOL、mito-TEMPO、ポルフィリンベースの「SOD 模倣物」など、「抗酸化剤」としてよく使用される他の薬剤は、生体内で複雑な酸化還元反応を起こすため、「抗酸化剤」や「O2」よりも「酸化還元調節剤」と呼ぶ方が適切です。 •− スカベンジャー 1、20、21。推奨事項 2: 介入が抗酸化活性に起因すると考えられるためには、「抗酸化物質」が標的とする特定の化学種を明示する必要がある。低分子量の「抗酸化物質」が H2O2 を除去することによって作用する可能性は低いことを認識する必要があります。細胞内の抗酸化物質の特異性、速度定数、位置および濃度により、抗酸化効果が化学的に妥当なものとなるはずです。可能な場合は常に、酸化損傷の減少を測定することによって抗酸化物質の活性を確認する必要があります。

酸化的損傷、または酸化還元シグナル伝達経路の活性化を特定の ROS に帰する重要な手順は、生物学的状況における ROS の選択的生成によるものと考えられます。これは、パラコート (PQ) やキノンなどの酸化還元サイクル化合物を使用して O2・- を生成するか、MitoPQ を使用してミトコンドリア内で O2・- を生成することによって行うことができます 1,22。もちろん、O2・- 生成の増加は、O2・- 不均化による H2O2 生成も増加します。グルコースオキシダーゼは、in vitro で H2O2 を直接生成するために使用できますが、細胞内での H2O2 の制御された生成は、d-アミノ酸を酸化するときに H2O2 を生成する酵素である遺伝子発現 d-アミノ酸オキシダーゼを使用して実現できます 23。細胞内のさまざまな部位を標的にすることができ、その基質である d-アラニンの添加濃度を変えることでフラックスを制御できます23。 NADPH オキシダーゼ (NOX) 酵素は、酸化還元シグナル伝達および酸化損傷のための O2・- および H2O2 の重要な供給源であり 9,24、その活性の調節はこれらのプロセスを理解するための重要なアプローチです。 NOX 酵素のかなり特異的な阻害剤が多数報告されています 24。しかし、アポシニンやジフェニレンヨードニウムなどの化合物は、特異性の欠如が十分に確立されているにもかかわらず、「NOX 阻害剤」として依然として広く使用されています 1,24。推奨事項 3: O2・- の選択的生成には PQ、キノン、MitoPQ の使用、および H2O2 の制御生成には d-アミノ酸オキシダーゼの細胞発現を推奨します。アポシニンまたはジフェニレンヨードニウムによる現象の阻害を NOX 酵素の役割の唯一の証拠として使用することは避けるか、少なくともそれらの特異性の欠如について議論してください。特定の阻害剤 24 または NOX 成分の欠失またはノックダウンを使用して、その役割を特定する必要があります。

生物系における ROS を調査する場合、目的の ROS を検出して定量することが重要です。これは、電子常磁性（スピン）共鳴（EPR/ESR）、さまざまなプローブ分子を使用するか、ROS1 によって引き起こされる酸化修飾（「酸化損傷」、Box 1）を測定することによって行うことができます。ほとんどの ROS プローブは、形成された ROS のほんの一部しか捕捉しません。実際、プローブが生成された ROS のほとんどと反応すると、システムが混乱し、実験結果に影響を与える可能性があります (酸化損傷の阻害や酸化還元シグナル伝達の妨害など)。ただし、問題の ROS の生成速度が異なっても、捕捉率がほぼ一定に保たれることが重要です。

酸化損傷にはさまざまな形があります。特定の ROS からそれが生じる化学プロセスと、それがどのように評価され定量化されるかは複雑です。さらに、測定される酸化損傷バイオマーカーの最終レベルは、その生成速度と修復、分解、排泄または拡散による除去との差です。推奨事項 4: 生体分子に対する酸化損傷レベルが提示される場合、それらが生じる化学プロセスとそれらを定量化するために使用される方法を明示する必要があります。測定された最終レベルに対する修理とクリアランスの影響を考慮し、議論する必要があります。

ROS、抗酸化物質、酸化損傷を一枚岩の概念として考慮すると、実験の精度と解釈が制限され、正確な分子機構を確立する必要性が曖昧になります。これらの教訓を実践するには、抗酸化物質の効果だけでなく、特定の ROS および/または酸化損傷生成物の測定が必要です。ほとんどの ROS は寿命が短く（寿命がミリ秒以下）、定常状態のレベルが低く（ピコモルから低マイクロモル）、連続的に変化する生成速度、化学物質の影響を受けるため、急速に変化するため、これは現実的な大きな課題です。反応と拡散。

単純な in vitro システムでは、いくつかの ROS を検出することが可能です (表 2)。例えば、Ｏ２・－生成はシトクロムｃの還元によって監視でき、その選択性は添加されたＳＯＤによる阻害によって評価できる。ただし、そのような「単純な」システムであっても、驚くほど複雑になる場合があります。たとえば、セミキノンは、SOD25 によって阻害される反応においてシトクロム c を還元する可能性があります。肝心なのは、ROS を評価するために使用されるすべての方法はアーチファクトの影響を受けやすく、測定される種と量を特定するには適切な制御が必要であるということです。したがって、方法固有のアーティファクトを回避するために、異なる検出方法を使用した代替アプローチに依存する「直交技術」で測定を裏付けることが重要です。細胞内の ROS を測定しようとすると、これらの複雑さはさらに大きくなります。一般的に使用される細胞培養条件は、培地中の抗酸化物質が限られていることと、生体内と比較して O2 濃度が高いことにより、酸化損傷を促進します26。その結果、培養細胞は、これらの細胞が生体内で生成するよりも多くの ROS を生成します。

推奨事項 5: 測定される実際の種と検出方法がキットの資料で説明されており、化学的に妥当であり、限界が理解されている場合にのみ、市販のキットを使用してください。このような情報のない市販キットの使用は強く推奨されません。メソッド固有のアーティファクトを回避するには、さまざまな検出原理に依存する手法を使用して結果を確認します。

小分子蛍光プローブは、細胞内の ROS を評価するために頻繁に使用されます。場合によっては、キットを使用する場合が多く、これらのプローブの化学反応性や構造の説明が不足しているため、結果の解釈が困難になるため、そのようなプローブは避けるべきです。既知の構造のプローブであっても懸念が生じる可能性があります。広く使用されている蛍光プローブ 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン (DCFH) について考えてみましょう。通常、細胞に容易に侵入するジアセテート (DCFH-DA) の形で投与されます。 DCFH は、いくつかの ROS によって蛍光生成物 2',7'-ジクロロフルオレセイン (DCF) に酸化されるため、特定の ROS6、7 に特異的ではありません。 DCFH は H2O2 によって直接酸化されるのではなく (H2O2 が検出されるとよく主張されています)、H2O2 がレドックス活性金属またはシトクロム c やペルオキシダーゼなどのヘムタンパク質によってより反応性の高い種に変換された後にのみ酸化されます。さらに、DCFH の酸化と DCF の蛍光は局所的な O2 レベルと pH に敏感であり、蛍光収量は ROS レベルの増加に伴って直線的ではない可能性があります 27、28、29。これは、DCFH やジヒドロローダミンなどの他の非特異的蛍光プローブを決して使用すべきではないということではありませんが、それらの限界 (選択性、定量化の問題、応答の直線性、アーチファクトの影響を受けやすいこと) を理解し、結果を慎重に解釈する必要があります 28。特に、これを検証するための詳細な制御なしに、それらの応答が特定の ROS に起因すると考えるべきではありません。また、それらの使用は、細胞の酸化還元状態の変化の初期評価に限定され、その後、メカニズムのより詳細な調査が行われる必要があります。多くの小分子およびタンパク質の蛍光プローブは DCF よりも選択的ですが、多くの単純なコントロールによってデータを検証することが常に重要です。つまり、応答は経時的および生物学的サンプルの量に応じて妥当な方法で変化しますか? この効果は、目的の ROS を生成することによって再現できますか (たとえば、O2•- には PQ、H2O2 には d-アミノ酸オキシダーゼを使用)。 ROS 生成プロセスを廃止する必要があるネガティブコントロール (遺伝子ノックアウト、ノックダウン、阻害剤、ラジカルスカベンジャーなど) は期待どおりに反応しますか? 推奨事項 6: 蛍光 ROS プローブ (特に DCFH-DA) を使用する場合、関与する化学、特定の化学種に対する選択性、および潜在的なアーティファクトを明確にし、議論する必要があります。可能な限り、応答が提案された種によるものであることを示すための制御を実行し、結論を裏付けるために直交技術を使用する必要があります。

培養細胞から生体内または生体外の組織まで ROS の測定を拡張することが重要です。ただし、場合によっては、このギャップは、生体外で新鮮または事前に凍結した組織切片またはホモジネートに「ROS プローブ」を添加することで解決されています。 ROS の寿命が非常に短いということは、生体内に存在する物質は物質が分析されるまでにずっと消滅していることを意味するため、これらの測定は無意味である可能性があります。さらに、凍結または均質化により膜が破壊され、基質とイオンの濃度が変化します（たとえば、Ca2+ または「触媒」Fe2+ のレベルが上昇します）1。そのため、組織切片またはホモジネート中の ROS 生成は、本来のレベルとは無関係になります。生体内で生成されます。 in vivo または灌流臓器で ROS を評価するために利用できる有効な方法がありますが、このような状況では、プロセスを in vivo で監視するか (たとえば、H2O2 を測定するためのカタラーゼ化合物 I の使用については表 2 を参照)、システムをクエンチして、 ex vivo での分析のためにプローブを安定化します。推奨事項 7: ROS の測定は、in vivo または ex vivo で生理学的に適切な条件下で細胞、組織、または器官内で実行されるべきです。細胞/組織/器官が生物学的に適切な条件下にある場合に、使用するプローブまたはセンサーが反応種を不可逆的に捕捉できる場合を除き、組織ホモジネートまたは凍結切片で ROS を「測定」すべきではありません。

ここでは、一般的に発生する ROS を測定するための現時点で最善のアプローチであると考えられるものの概要を説明します。

単純なシステムでは、O2・-は、SODによって阻害されるシトクロムcの還元など、さまざまな方法で測定できます（参考文献25）。 O2・- の生成は、スピントラッピングとそれに続く EPR によっても評価できます。これには、ラジカルを直接検出できる利点があります 1。アコニターゼの Fe-S クラスターは O2•- や他の ROS によって不活化されますが、O2•- との相互作用は高速で適度に特異的で可逆的であるため、ミトコンドリアの O2•- の優れた指標となります 30。化学発光「スーパーオキシドプローブ」であるルミノールとルシゲニンは、「O2・-の検出」に広く使用されていますが、これらのプローブはそれ自体でO2・-を生成するラジカルを生成するため、そのようなデータの解釈は困難です。それらは O2•- と直接反応しません 31,32。

推奨事項 8: ルミノールとルシゲニンを「O2•- の検出」に使用することは推奨されませんが、ROS 産生の増加の一般的な指標として使用できます。 in vitro での SOD 感受性のシトクロム c の減少とミトコンドリア内のアコニターゼの不活化は、より良い戦略です。

細胞では、O2・- は、ジヒドロエチジウム (ヒドロエチジン (HE) と呼ばれることもあります) またはミトコンドリア標的 HE (MitoSOX) の酸化から生じる蛍光を測定することによって検出されることがよくあります。残念ながら、これらのプローブは非特異的酸化生成物であるエチジウム (E+) と O2・- 特異的生成物 2-ヒドロキシエチジウムの両方を形成するため、蛍光による検出は誤解を招きます。これら 2 つの製品は重複する蛍光スペクトルを持っているため、全体の蛍光に対する非特異的酸化と O2・ - 依存性酸化 (存在する場合) の寄与を区別するのは困難です 33。 2-ヒドロキシエチジウム生成物の正確な定量は、液体クロマトグラフィー - 質量分析 (LC-MS) を使用して行うことができます33。考慮すべきもう 1 つの要素は、HE/MitoSOX の細胞取り込みの程度、およびこれらとその複数の生成物の細胞内濃度です。さらに、HE 酸化生成物は DNA に挿入され、その蛍光を大幅に増強し、別のアーチファクトを生成します。 NeoD と MitoNeoD には、DNA に挿入されない修飾された HE が含まれています 34。

MitoSOX などのミトコンドリアに蓄積された O2・- プローブは、ミトコンドリア内の「O2・- を検出する」ためによく使用されます。これらのプローブや、正電荷を持つプローブや正電荷種（2-ヒドロキシエチジウムやエチジウムを含む）を生成する他のプローブを使用する場合、プローブの蓄積は血漿およびミトコンドリアの膜電位、ミトコンドリアのサイズ、形状、質量に依存することを覚えておくことが重要です35。さらに、これらがミトコンドリア内に高濃度で存在すると、蛍光が消光する可能性があります36。

推奨事項 9: 製品が 2-ヒドロキシエチジウムとして独立して検証されている場合、単純な蛍光測定による O2・検出には HE または MitoSOX プローブのみを使用してください。ジヒドロエチジウムや MitoSOX33 などのプローブを使用した蛍光測定は、可能な限り最低のプローブ濃度を使用して実行する必要があり、同様の膜電位応答性への正規化など、血漿およびミトコンドリアの膜電位、ミトコンドリアの質量および形態の変化の制御を含める必要があります。酸化還元非感受性のプローブ。すべての修飾種 33 を測定する LC-MS 法は、可能であれば実行する必要があります。

単純なシステムでは、H2O2 はホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 酸化基質によって測定できます。よく使用される基質の 1 つは Amplex Red です。これらの方法は、他の HRP 基質 (アスコルビン酸塩や NAC など)1 や O2・- (HRP を不活性化する可能性がある) によって妨害される可能性がありますが、後者は SOD37 の添加によって防止できます。 H2O2 は直接またはアクアポリンを介して膜を通過できるため、このシステムは細胞からの H2O2 放出の測定にも使用できます。ただし、この放出は H2O2 の生成、細胞内酵素による除去、および細胞外への拡散速度の間のバランスを反映していることに注意してください。

細胞内では、フェニルボロネートベースのプローブによる H2O2 検出の信頼性がより高くなります 38 が、これらは H2O2 との反応が遅いため十分な感度に欠ける可能性があり、そのため H2O2 レベルの小さな変化や局所的な変化を検出することが困難になる可能性があります 39。しかし、最近の研究では、H2O2 とより迅速に反応するボリン酸の方が、より感度の高い検出器である可能性があることが示唆されています40。フェニルボロン酸塩のフェノールへの酸化機構には、H2O2 などの 2 電子酸化剤が必要です。 H2O2 は通常、他の ROS よりも高濃度で生成されるため、ボロン酸塩プローブは、適切な制御の下で H2O2 検出に選択的になります 39,40。ただし、ボロン酸プローブは、H2O2 よりも ONOO-/ONOOH または HOCl とはるかに速く反応するため、測定が複雑になる場合があり、直交アプローチまたは阻害剤の使用は検証に役立ちます 41。たとえば、H2O2 依存シグナルとペルオキシ亜硝酸依存シグナルは、一酸化窒素シンターゼ (NOS) 阻害剤とカタラーゼ 38、39、41、42 を使用して区別できます。

遺伝子的にコードされた蛍光タンパク質センサーは、細胞の H2O2 検出に大きな進歩をもたらしました 43、44、45、46。これらのプローブには、酸化状態に応じてプローブ全体の蛍光を変化させるジチオールスイッチが含まれています。 H2O2 に対する高い感度と特異性は、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質 (GFP) 変異体を、oxyR (HyPer シリーズ) などの H2O2 感受性チオールタンパク質、または Orp1 や TSA2 (roGFP2-ベースのプローブ)。ペルオキシレドキシンと結合した HyPer7 および roGFP2 は、最高の感度を提供します 44,45。 HyPer7 および roGFP2 ベースのプローブは pH に安定していますが、HyPer の以前のバージョンは安定していないため、pH43 の変動によるシグナル変化を制御するためにコントロールプローブ (SypHer) の発現が必要です。通常は蛍光顕微鏡による画像解析が使用されますが、蛍光プレートリーダーも使用できます。測定された酸化還元状態は、グルタレドキシン/GSH およびチオレドキシンなどの細胞還元剤によるプローブの酸化速度と再還元速度のバランスを表し、酸化還元状態のリアルタイムの生細胞評価を可能にします。還元プローブと酸化プローブの両方の励起波長が使用されるため、プローブはレシオメトリックであり、出力はタンパク質プローブの発現レベルに依存しません。適切なターゲティング遺伝子配列を組み込むことにより、これらのプローブは、ミトコンドリア、微小管、小胞体、核、細胞質などのさまざまな細胞コンパートメントに向けることができます43、44、45、46。したがって、関心のある細胞内領域を研究し、最後に完全還元 (2 mM ジチオスレイトール)、ウォッシュアウトおよび完全酸化 (2 mM t-ブチルヒドロペルオキシド) によってプローブを校正することができます 44,45。このキャリブレーションにより酸化パーセンテージの測定値が得られ、実験間および細胞内コンパートメント間での比較が可能になります 44,45。これらのプローブは、インビボ H2O2 生成の有用な評価を提供するためにトランスジェニック動物で発現されています 46,47。ウイルスベクターのプラスミドトランスフェクションは培養細胞で使用でき、ターゲットを絞った roGFP2 プローブは市販されています (www.addgene.com)。

ほとんどの実験では、H2O2 プローブは細胞内に分布する遊離タンパク質として発現されます。それにもかかわらず、細胞内 H2O2 拡散距離に関する不確実性を考慮すると、細胞内 H2O2 分布を理解するためにどの程度の分解能が必要かは依然として不明です。したがって、H2O2 プローブをタンパク質複合体や細胞小器官接触部位などのサブコンパートメント位置に繋ぎ留めることは重要なアプローチです。

推奨事項 10: 遺伝的にコード化された蛍光プローブ (一部は市販されています) は現在、H2O2 の最も感度の高い検出器であり、発現が可能であれば細胞や動物での使用を推奨します。ボロン酸塩プローブ (一部は市販されています) が好ましい小分子プローブですが、H2O2 に対する特異性を決定するためのコントロールが必要であり、生理的 H2O2 レベルに対する感度は制限されます。 HRP を含む Amplex Red は、他の還元剤またはペルオキシダーゼ基質が存在しない場合に、細胞からの H2O2 放出を測定できます。

ペルオキシ亜硝酸塩 (ONOO-) は複雑な化学反応を示し 42,48,49 、それ自体特定の生体分子を酸化する可能性があります。主な生理学的反応は CO2 によるものであり (表 1)、したがって、生物系の CO2/ \({{{\mathrm{HCO}}}}_3^{- }\) 含有量は生物学的影響の決定に役割を果たします 50 ＯＮＯＯ−。この反応の生成物には、炭酸ラジカルアニオン (CO3・-) やニトロ化剤の二酸化窒素 (NO2・) (表 1) などの反応種が含まれ、どちらも一般的な「ROS プローブ」の多くと反応します。ペルオキシ亜硝酸塩はボロン酸ベースのプローブを H2O2 よりも 100 万倍近く速く酸化し、適切な条件下では、これらのプローブを使用して ONOO-/ONOOH 生成を評価できます 42,49。ペルオキシ亜硝酸塩は、ボロン酸塩プローブを使用して生体外で組織内で測定されています51。

HOCl、次亜臭素酸 (HOBr)、およびそれらに由来する一部のクロラミンおよびブロマミン (表 1) は、DCFH やルミノールなど、ROS の検出に使用される一般的なプローブのほとんどと反応します。しかし、これらのプローブの多くは、HOCl または HOBr を生成するペルオキシダーゼの基質でもあり、その使用を混乱させます。反応性ハロゲン種に対するより特異的な蛍光プローブが報告されており、一部は市販されています52。反応性ハロゲン種の遺伝的にコードされたプローブが開発され、細胞培養と生体内両方でこれらの種の動的なモニタリングが可能になりました53。

ROS の存在は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質に対する ROS の影響によって推測され、他のメカニズムによって形成されない限り、酸化的損傷の「バイオマーカー」として使用できる特定の化合物を生成します (ボックス 1)。 1、54、55。ただし、測定されたバイオマーカーのレベルは、バイオマーカーの生成と除去 (分解、拡散、排泄などによる) と、分離または分析中の酸化損傷によって引き起こされる人為的な増加レベルとの間のバランスを表すことに注意してください。

多価不飽和脂肪酸（PUFA）は容易に酸化されるため、脂質過酸化生成物は酸化的損傷を特徴付けるために広く使用されています56、57、58。脂質過酸化は、特定の ROS によって開始され、ランダムな非酵素的 (多くの場合連鎖的) ラジカルプロセスとして進行します。ただし、生物学的役割を持つ特定のシグナル伝達産物を生成する遊離 PUFA または PUFA リン脂質の過酸化に利用できる酵素機構 (リポキシゲナーゼなど) も存在します。したがって、脂質過酸化を測定する場合、(1) 酸化的損傷の例としての脂質過酸化の増加の確立、または (2) 特定の細胞標的との選択的相互作用によってシグナルとして機能する個々の酸化的に修飾された脂質分子の同定のいずれかに焦点が置かれる可能性があります。

PUFA では、メチレン基に隣接する二重結合の存在によりメチレン C-H 結合が弱くなり、そのためビスアリル水素が H・引き抜きを受けやすくなります 56,57,58。 H・引き抜きによって生成された炭素中心のラジカル (L) は、二重結合上の非局在化によって安定化されます。続いて O2 と反応すると、共役ジエン系とさまざまな過酸化物 (LOOH) が形成され、ペルオキシルラジカル (LOO) が生成されます。 LOO・はさらに反応して、エポキシ、オキソ、または環状過酸化物などの高度に酸化された二次生成物を生成する可能性があります56、57、58。したがって、脂質過酸化の最終生成物は、化学的に非常に不均一性があり、安定性と極性が多様であるため、単一の酸化生成物の測定だけでは脂質過酸化のプロセス全体を表すことはできません。

「一般的な」脂質過酸化を評価するには、いくつかの方法が利用できます。単純なモデル系 (単離されたリポタンパク質など) では、ジエン共役は紫外 (UV) 吸光度によって測定できますが、この方法は、干渉する UV 吸収分子が存在するため、細胞や体液での使用には適していません。脂質過酸化から1. 細胞では、「脂質過酸化」は、過酸化感受性ウンデカン酸部分に結合したBODIPYの蛍光の変化によって評価できます59。このアッセイは技術的には簡単ですが、BODIPY のペルオキシルラジカルとの反応速度はラジカル消去型抗酸化物質の反応速度よりも遅いため、慎重に解釈する必要があります。したがって、抗酸化物質による BODIPY 蛍光の抑制は、脂質過酸化を抑制する抗酸化物質の能力を必ずしも反映する必要はありません 59。脂質過酸化の別の蛍光分析アッセイでは、4 つの共役二重結合を持つ脂肪酸であるシスパリリン酸 (PnA) を使用します。 PnA が酸化すると、その共役系が破壊され、したがって蛍光が破壊されます。 PnA はさまざまな種類のリン脂質に組み込まれている可能性があるため、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で分離すると、さまざまなリン脂質の酸化に関する情報が得られます 60。しかし、PnA の高い酸化速度、光退色に対する脆弱性、およびさまざまなリン脂質への PnA の代謝的取り込みが変化するため、PnA ベースの結果を内在性リン脂質の酸化に外挿することは困難です60。

脂質過酸化は、α,β-不飽和ヒドロキシアルケナール61などの最終生成物の測定によって、理想的にはMSベースの技術によって評価されることがよくあります。特に、4-ヒドロキシノネナール (HNE) の形成は広く使用されています。 HNE によって形成されるタンパク質付加物に対する抗体は広く入手可能であり、組織の免疫染色に頻繁に使用されますが、異なる抗体は異なるエピトープを検出できるため、HNE がタンパク質内のどのアミノ酸残基に結合するかに応じて異なる答えが得られることを認識する必要があります 61。 62、63、64。

脂質過酸化の主要な最終生成物の 1 つはマロンジアルデヒド (MDA)61 です。これも MS 技術で測定すると有用なバイオマーカーとなり得ます。しかし、チオバルビツール酸反応性物質（TBARS）を利用する広く使用されている「MDA アッセイ」は、TBA が MDA 以外の多くの生体分子から色原体を生成するため、非特異的です1,65。 HPLC を使用して「本物の」TBA-MDA 付加物を偽色原体から分離すると、特異性は高まりますが、すべての問題が解消されるわけではありません 1。

推奨事項 11: 簡易 TBA 検査 (TBARS) またはその使用に基づくキットの細胞、組織、または体液への適用は、特異性が低いため、酸化的脂質損傷の評価に使用される唯一の検査として推奨されません。偽陽性の結果。 HPLC ベースの TBA テストはアーチファクトが発生しにくいです。

脂質酸化生成物の検出は、酸化脂質混合物の詳細な分析のための LC-MS の開発により革命をもたらしました 66。人為的な過酸化を避けるためのサンプルの収集と保管は、脂質過酸化研究の鍵であり、後の分析のためにサンプルは液体窒素で直ちに凍結する必要があります。生体流体には、保管中の自動酸化を防ぐために化学物質（ブチル化ヒドロキシトルエンなど）の添加が必要な場合があります1,67。定量に使用する内部標準は、溶媒抽出の前にサンプルに添加する必要があります。このような LC-MS ベースのメソッドには、高感度、少量のサンプル量しか必要とせず、脂質過酸化の複数の最終生成物を検出できるという利点があります。このため、LC-MS プロトコルは、一般的な脂質過酸化の評価と、特定のシグナル伝達機能を持つ製品を含む個々の製品の同定に最適な方法となります。ただし、利用可能な標準の制限により、特定の製品の定量分析ができない場合があります。このような研究では、方法論に細心の注意を払う必要があります68。

MS ベースのアプローチによって定量化された脂質酸化生成物の中で顕著なものは、F2-イソプロスタン (F2-IsoP) です 69。 64 の F2-IsoP 立体異性体は、フリーラジカル誘導によるアラキドン酸の非酵素的酸化から生成され、シクロオキシゲナーゼ酵素 (COX-1/ -2)。 F3-イソプロスタンと F4-イソプロスタンは、それぞれエイコサペンタエン酸 (EPA) とドコサヘキサエン酸 (DHA) から生じますが、F2-イソプロスタンほど特徴はよくわかっていません。 ELISA 法は、F2-IsoP 異性体の 1 つである 8-iso-PGF2α (15-F2t-IsoP または iPF2α-III とも呼ばれます) を定量するために開発されており、ガスクロマトグラフィー MS および LC タンデム MS (LC-MS) と比較されています。 /MS) メソッド69、70、71、72、73。これらすべての研究において、市販の ELISA キットと MS 法の間にはあまり一致がありませんでした。 8-iso-PGF2α は、アラキドン酸過酸化中に生成される 64 種類の異なる F2-IsoP 異性体の 1 つであり、8-iso-PGF2α と関連異性体間の抗体交差反応性は困難です。分析前にサンプルをクリーンアップすると、ELISA による 8-iso-PGF2α のより正確な測定が可能になる場合があります 72,73 が、これまでのところ F2-IsoP を定量する最も正確な方法は LC-MS/MS によるものであり、非常に強く推奨されます。

推奨事項 12: F2-IsoP は脂質過酸化のバイオマーカーとして一般に受け入れられていますが、F2-IsoP は多くの最終生成物の 1 つであり、さまざまな種類のレベルは実験条件によって影響を受ける可能性があることを認識する必要があります 69。 ELISA を使用した定量はアーチファクトの影響を受けやすいですが、サンプルをクリーンアップすると ELISA73 による 8-iso-PGF2α の測定が可能になる場合があります。適切な内部標準を使用した LC-MS/MS が推奨されるアプローチです。

タンパク質のアミノ酸残基は酸化修飾の影響を受けやすく、その一部の形態は有用なバイオマーカーを提供します 74,75。複数の製品を測定するための詳細なプロトコルについては、参考文献を参照してください。 76、77。一般的なタンパク質修飾は、特定のアミノ酸残基が酸化されてカルボニル基を有する生成物になることによる「タンパク質カルボニル」の形成です。カルボニルは、アルデヒドとタンパク質上の求核部位との反応または糖化によっても形成されます 75,77。多くのアッセイでは、2,4-ジニトロフェニルヒドラジンによるカルボニル基の誘導体化により、ジニトロフェニルヒドラゾン (DNP) を形成します。この生成物は分光光度法で検出できますが、このアプローチではバックグラウンドが高く、再現性が低いという問題が生じる可能性があります。これを回避するには、測定前に DNP 付加物を LC で分離します。あるいは、カルボニルは、ELISA または免疫ブロット法による DNP 製品に対する抗体を使用して検出できます 78。タンパク質のカルボニルの変化は、ゲル電気泳動で分離できる蛍光標識タンパク質を生成するフルオレセイン-5-チオセミカルバジド（FTC）で処理した組織ホモジネートで測定できます79。ビオチンタグ付き誘導体化と LC-MS 検出を組み合わせた濃縮方法が開発されています 80。タンパク質カルボニル、α-アミノアジピン酸セミアルデヒドおよびグルタミン酸セミアルデヒドも、安定同位体希釈分析 LC-MS/MS77 によって個別に分析されています。もちろん、単一時点のデータは、これらの生成物の形成速度と除去速度 (修復やタンパク質分解など) の違いを反映しています。

MS を使用したタンパク質分析により、特徴的な質量増加を伴う修飾 (水酸化、ニトロ化、塩素化など) の検出と同定が可能になります 75,76。これは、「レドックスプロテオミクス」による認知症患者の脳タンパク質への酸化的損傷の研究において特に有用である81。タンパク質分解による切断後のペプチドレベルのマッピングにより、修飾の性質、タンパク質配列内でのその位置、およびそれに伴う親ペプチドの損失の検出が可能になり、相対的な定量化が可能になります。完全消化後のアミノ酸分析により、親種とともに特定の種の種類と絶対濃度（同位体標識標準の使用によって決定）を決定でき、「質量バランス」を決定できます75、76、77、82。タンパク質の酸化的損傷の生成物の一部は不安定であるため、Cys または Met の人為的酸化を防ぐため、またタンパク質の加水分解中にもサンプルの取り扱いには注意が必要です。 LC-MS 分析には、高い特異性、高感度、多くの異なる修飾と親種を同時に検出できる能力、HOCl83 やニトロ化種からの塩素化など、関与する ROS を診断する生成物を検出できる能力など、多くの利点があります。 NO2-の存在下でのミエロペルオキシダーゼの作用および/またはONOO-/ONOOHの反応によって生じる49,84)。これらの LC-MS アプローチは、単離されたタンパク質から組織サンプルに至るまでの幅広い材料に対して実行できます。サンプルの取り扱いや調製から生じる潜在的なアーチファクトを克服するには、未修飾のアミノ酸またはペプチド、できれば添加された重同位体標識物質と比較した定量を推奨します。ただし、血漿および尿中の酸化アミノ酸レベルには、食品中のタンパク質からの酸化アミノ酸の吸収、または病状の結果としての組織タンパク質分解の増加が寄与している可能性があることに留意してください。これらはどちらもまだ詳細に研究されていません。

システインは、その酸化のしやすさ（特にチオラート型 RS-）と求核性により、修飾の主なターゲットとなり、求電子試薬との付加形成が容易になります。酸化は、たとえばスルフィン酸やスルホン酸に対して不可逆的な場合があり、これらは酸化的タンパク質損傷の有用なバイオマーカーとなりえます4,85。タンパク質の Cys 残基の可逆的酸化は、酸化還元シグナル伝達の顕著なメカニズムです 2,4。可逆生成物には、ジスルフィド、スルフェン酸、S-ニトロソチオール、過硫化物種が含まれます2、4、85、86、87。これらの修飾は、GSH/グルタレドキシンまたはチオレドキシン系によって元に戻すことができます87。可逆的に修飾された Cys 残基のプールを検出する一般的なアプローチは、最初に還元されたチオールを反応性試薬でブロックし、次にトリプシン消化物の LC-MS によって識別できるタグで以前に酸化された残基を還元および誘導体化することです 88。これらのアプローチは、修飾特異的化学の使用に拡張して、S-ニトロソチオール、スルフェン酸、過硫化物などの特定の酸化生成物のみをタグ付けすることができます88。最近まで、これらのアプローチの主な制限は、全 Cys プールの範囲が低いことと、個々の残基での修飾の定量ができないことでした 87、88、89。後者は、可逆的修飾の生物学的重要性を解釈する際に特に重要です。同重体タグ付けによって定量化の大幅な改善が達成されました。同重体タグ付けでは、最初に還元された Cys 残基が 1 つのタグで標識され、可逆的に修飾された残基が還元され、次に化学的に同一であるが重同位体修飾されたタグで標識され、その割合の定量化が可能になります。特定の Cys ごとに酸化されます。これらの方法はビオチンなどの部分を組み込んだタグにまで拡張されており、これにより標識ペプチドの濃縮が可能になり、Cys のカバー率が大幅に向上します。 OxiMOUSe 研究 89 で例示されているように、このアプローチの最新の反復は、以前の方法に取って代わりました。

メチオニンは、酸化還元翻訳後修飾の主要な部位でもあります。メチオニンスルホキシドへの酸化は、メチオニンスルホキシドレダクターゼ酵素によって酵素的に逆転することができ、単一の酸素原子の挿入/除去によって酸化還元シグナル伝達を促進する可能性があります17。プロテオーム内の酸化還元感受性メチオニン部位を特定し、特徴付けることができるメチオニン生体結合用の試薬が開発されています90。

推奨事項 13: ELISA、FTC、およびイムノブロッティングは、一般的な酸化タンパク質損傷のバイオマーカーとしてタンパク質カルボニルの検出に有用なツールですが、すべてのタンパク質酸化生成物にカルボニルが含まれているわけではないことを認識する必要があります。慎重に調製したサンプルを使用する LC-MS アプローチは、これらの方法で利用できる感度、選択性、および定量性により、タンパク質酸化の評価に利用できる最良の技術です。個々の酸化生成物に対する特異的で検証済みの抗体 (下記参照) などの直交的なアプローチの使用も推奨されます。

DNA および RNA の酸化修飾は、酸化損傷のバイオマーカーとしてよく使用されます 1,13,91。細胞内の DNA に対する「一般的な」酸化損傷を評価するために使用される 1 つの方法は、DNA 鎖切断を検出するコメットアッセイです。このような切断は、必ずしも酸化損傷によるものではなく、いくつかのメカニズムによって発生する可能性がありますが、酸化部位で DNA に「ニックを入れる」修復酵素の使用により、酸化 DNA 損傷に対する特異性が高まります。最も簡単な測定は、顕微鏡スライド上のゲルに埋め込まれた細胞の電気泳動後の DNA「ゴースト」の長さです92。

DNA への酸化的損傷は通常、グアニンの 8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8OHdG または 8-oxodG) への酸化に焦点を当てます。他の塩基の修飾に関するデータは限られていますが、これらは生物学的に重要である可能性があります 1,13。これらの測定では、DNA の単離と修飾塩基を放出するための消化が必要であり、サンプルの取り扱いや分析中に誤った酸化が発生する可能性があります。複数の研究室による取り組み93は、これを回避するためのプロトコルを確立し、8OHdGの「正常な」レベルを決定しました。 DNA 内で測定される 8OHdG (またはその他の酸化的 DNA 損傷生成物) の量は、酸化速度と修復速度のバランスになります。最良の方法論は、超高性能 LC-MS/MS (UPLC-MS/MS)94 です。 ELISA 法の使用には注意が必要です。ELISA 法は感度と特異性に欠け、バッチ間で結果が異なる可能性があり、8-ヒドロキシグアノシン (8OHG) と 8OHdG の間に交差反応が発生することがあります。しかし、免疫組織化学は、適切に適用されれば、in vivo でより多量の 8-OHdG を持つ細胞の同定に役立ちます 95。

DNA と RNA の両方からの酸化ヌクレオシドは、さまざまな体液で検出できます。当初、それらは DNA 修復、特にヌクレオチド除去修復から生じると考えられていました。しかし、それらは、酸化生成物の除去によって「衛生化された」DNA および RNA ヌクレオチド前駆体プールの酸化からも発生します 94。体液中で検出される酸化ヌクレオシドのレベルに対する DNA 修復とヌクレオチドプールの浄化の相対的な寄与は、現在不明です。 24 時間にわたって収集された尿は、その期間中に酸化された DNA/RNA および/またはそれぞれのヌクレオチド前駆体プール内のグアニンの数を表します 96。尿サンプリングは体全体の形成を表し、すべての組織が影響を受けていると想定される状況に最適ですが、特定の臓器でのみ発生する変化の検出には不十分な可能性があります。特定の組織での測定は、生成と修復の間のバランスのスナップショットとなり、他の臓器のプロセスを表すものではない可能性があります。

推奨事項 14: 抽出された細胞または組織サンプルからの核酸の酸化修飾を測定する場合、調製および分析ステップでの誤った酸化を避けるために細心の注意を払う必要があります。単離された細胞に対するコメットアッセイ（DNA 修復酵素を使用）や、体液または組織から抽出された核酸中の 8OHdG および 8OHG を測定する UPLC-MS/MS などの方法が、現在利用できる最良の方法です。 ELISA ベースのメソッド、特にキット形式のメソッドは、通常、十分に検証されておらず、その使用は推奨されません。

上で説明したように、抗体は、タンパク質 (カルボニル、3-ニトロチロシン、3-クロロチロシンなど)、DNA (8-oxodG など)、脂質 (F2 など) 上に形成される酸化生成物 (および付加物) を検出するために広く使用されています。 -イソプロスタン）。これらは、ELISA、免疫組織化学、免疫沈降形式などで使用されていますが、多くの場合、バックグラウンド反応性、交差反応性、特異性の欠如に悩まされています。これに対処するには、抗体の生成に使用されるエピトープを文書化する必要があり（たとえば、HNE の場合）62、63、64、バックグラウンドを除去するためのコントロールを含める必要があります。選択性を決定するには、エピトープの本物のサンプルによるブロッキングが推奨されます。相対的な定量化は可能ですが、たとえばエピトープへのアクセス性が低いため(たとえば、タンパク質では酸化生成物が埋もれている可能性があります)、絶対的な定量化は困難な場合があります。さらに、抗体は通常、構造化されていない化学修飾ペプチドに対して生成され、認識されるエピトープは必ずしも決定されているわけではありません。

推奨事項 15: 特定の製品に対する十分に検証された抗体は、非特異的相互作用を含む適切な注意と管理のもとで使用すれば、有用な検出ツールとなります。可能な限り、本物のエピトープを含む競合データを含める必要があります。

in vivo での ROS の測定は課題です。 EPR 手法は開発されていますが、まだ広く使用されていません。 ROS 検出への生物発光アプローチには、酸化時に in situ でルシフェリンを形成するペルオキシケージドルシフェリン-1 が含まれます。このルシフェリンは、ルシフェラーゼをトランスフェクトした系で酸化されて生物発光を生成します 97。前述のように、遺伝的にコード化された酸化還元バイオセンサーは動物研究で使用されています。改善された感度と検出手段の開発により、陽電子放射断層撮影法は現在、生体内での ROS の画像化に使用されています 98 が、まだ初期段階にあります。細胞および組織のミトコンドリアでは、ミトコンドリアを標的としたボロン酸 MitoB を使用して H2O2 の変化を評価できます。MitoB はこれらの細胞小器官に蓄積し、H2O2 によって MitoP に変換されます。 MitoP と MitoB の比率は MS99 によって決定できます。

酸化損傷は人間の多くの病状において中心的な役割を果たしているため、この損傷を軽減するための治療介入の開発に多大な関心が寄せられています1、2、3。必然的に、臨床試験では、これらの介入が酸化的損傷にどのような影響を与えるかを実証できるはずです。たとえば、β-カロテン、ビタミンC、ビタミンEなどの「抗酸化物質」を使用して多くの二重盲検ランダム化臨床試験が実施されてきましたが、これらは一般に疾患活動性に影響を与えることができませんでした。残念なことに、ほとんどの場合、酸化的損傷に対する介入の効果は測定されておらず、推定上の治療法が実際に酸化的損傷の軽減に効果的であるかどうかは不確実です。効果的でない場合、効果の欠如は予測可能です1,55。

これに対処するには、臨床試験で患者の酸化損傷レベルに対するこれらの介入の影響を評価することが不可欠です。現在、方法は生検（皮膚や筋肉など）、または臨床的にアクセス可能な体液（血漿、唾液、喀痰、尿、場合によっては脳脊髄液など）の酸化損傷のエンドポイントを測定することに限定されています。これらのバイオマーカーには、8OHG や 8OHdG100 などの核酸の酸化に関するバイオマーカーや、脂質過酸化のバイオマーカーとしての F2-イソプロスタンが含まれています 69,101。現在まで、臨床試験におけるタンパク質酸化のバイオマーカーの使用は限られています。しかし、タンパク質のチオール/ジスルフィド比の変化、タンパク質のカルボニルの増加およびその他の修飾と病態との強い関連性の証拠がある75、76、77。

より一般的には、臨床試験には国際的に検証されたバイオマーカーが含まれている必要があります。バイオマーカーは理想的には研究室間比較を受けている必要があります。多くのバイオマーカーは血漿などの体液中の濃度測定に依存していますが、これらは生成速度と排出速度のバランスのみを反映しているため、すぐに「酸化ストレス」として解釈することはできません。しかし、特定のバイオマーカーの 24 時間の産生を推定するモデルが開発されています 100。理想的には、バイオマーカーのパネルを使用する必要があります54,55。脂質、タンパク質、核酸に対する酸化的損傷の最終生成物は必ずしも相互に相関するわけではなく、また、それらは異なる ROS の異なる分子標的であるため、相関することも期待できないからです。

推奨事項 16: 抗酸化物質を使用して介入する場合、まず予備的な用量範囲研究でバイオマーカーを使用し、その介入が関連する生体分子への酸化的損傷を実際に減少させるかどうかを判断します。それらには、検証された方法論および/または直交的なアプローチで分析された、明確に定義されたバイオマーカーが含まれている必要があります。臨床（またはその他の）研究では、d-ROMS アッセイ（参考文献 1 で説明されている理由）、TBARS、総抗酸化活性の測定 1,102、またはキットの背後にある方法論が使用されるキットベースの方法の使用は推奨しません。明確ではない、または検証されていない、あるいはその両方です。

このコンセンサスステートメントの目的は、ROS を測定し、酸化イベントを評価してその生物学的重要性を調査する必要があると考えているさまざまな分野の研究者にとって有用なリソースを生成することです。私たちは現在使用されている多くの手順の制限について議論し、現在利用可能な最善のアプローチを提案してきました。将来的に新しい技術が開発され、適用されることは避けられませんが、16 の推奨事項 (図 1 に要約) に示されている、私たちの慎重な哲学の原則は今後も有効です。

ここでは、この原稿で開発されたベストプラクティスの推奨事項を要約して省略しました。

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紙面の制限と、コンセンサスステートメントに必要な範囲の広さのために、多くの重要な論文を引用できなかったことを同僚にお詫びします。原稿に関して有益なコメントをくださった AJ Kowaltowski に感謝します。 MPM の研究室での研究は、英国医学研究評議会からの助成金 (番号 MC_UU_00015/3) およびウェルカムトラスト調査員賞 (番号 220257/Z/20/Z) によって支援されています。 HB および VEK の研究室での研究は、米国国立衛生研究所 (NIH) によって支援されています (助成金番号 AI145406、CA165065、CA266342、HL114453、AI156924、NS076511、AI156923、NS061817 および NS117000)。 KJAD は助成金番号によってサポートされました。米国NIHの国立環境衛生科学研究所からのES003598、および助成金番号2001による。米国NIHの国立老化研究所からのAG052374。 RR は、ウルグアイ共和国大学からの助成金 (番号 CSIC_2018 および EI_2020) によって支援されました。 BH の研究室での研究は、シンガポール国立医学研究評議会、シンガポール国立大学、シンガポール国立研究財団、およびタンチントゥアン財団からの助成金によって支援されています。 CJC は NIH (番号 GM 79465、GM 139245、および ES 28096) によってサポートされており、CIFAR 奨学生です。 STの研究室での研究は、JST CREST（助成金番号：JPMJCR19H4）、JSPS科研費（助成金番号：JP16H06276[AdAMS]、JP19H05462、JP20H05502）および高松宮妃殿下がん研究助成金（番号19-25126）によって支援されています。）。 TPD の研究室での研究は、ドイツ研究評議会 (番号 DFG、TRR184 および SPP2306) および欧州研究評議会 (番号 742039) からの助成金によって支援されています。 HY の研究室での研究は、中国国立自然科学財団からの助成金 (番号 32030053 および 32150710522) によってサポートされています。 MJD の研究室での研究は、ノボノルディスク財団 (助成金番号 NNF13OC0004294、NNF19OC0058493、NNF20SA0064214) によって支援されています。 N.-GL の研究室での研究は、スウェーデン研究評議会 (2015-00418)、スウェーデンがん財団、クヌートおよびアリスワレンバーグ財団、欧州研究評議会 (Advanced Grant 2016-741366)、およびノボノルディスク財団によって支援されています。 BH は、ROS を測定するための疑わしいキットの問題を提起してくれた Alvin Loo に感謝しています。

MRC ミトコンドリア生物学ユニット、ケンブリッジ大学、ケンブリッジ、英国

マイケル・P・マーフィー

米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、ピッツバーグ大学小児神経科学研究所、サファール蘇生研究センター救命救急医学部門

フリャ・バイル

米国ペンシルバニア州ピッツバーグ、ピッツバーグ大学フリーラジカルおよび抗酸化健康センター環境労働衛生学部

フリャ・バイル＆ヴァレリアン・E・ケーガン

連邦脳研究および神経技術センター、モスクワ、ロシア連邦

フセヴォロド・ベロウソフ

カリフォルニア大学バークレー校、カリフォルニア州、米国

クリストファー・J・チャン

老年学、分子生物学および計算生物学、生化学および分子医学、南カリフォルニア大学、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

ケルビン・J・デイヴィス & ヘンリー・J・フォーマン

コペンハーゲン大学パヌム研究所生物医科学部、コペンハーゲン、デンマーク

マイケル・J・デイヴィス

ドイツがん研究センター、DKFZ-ZMBH アライアンスおよびハイデルベルク大学生命科学部、ハイデルベルク、ドイツ

トビアス・P・ディック

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タワーフィンケル

カリフォルニア大学自然科学部、マーセド、カリフォルニア州マーセド、米国

ヘンリー・J・フォーマン

ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、遺伝学、進化および環境学部、健康老化研究所、ロンドン、英国

イヴォンヌ・ヤンセン＝ハイニンガー

バーモント大学、バーリントン、バーモント州、米国

デビッド・ジェムズ

ウィスコンシン医科大学、ミルウォーキー、ウィスコンシン州、米国

バララマンカリヤナラマン

スウェーデン、ストックホルム、カロリンスカ研究所、医生化学および生物物理学科、分子代謝部門

ニルス＝ゴーラン・ラーション

米国テネシー州ナッシュビル、ヴァンダービルト大学医療センター医学部臨床薬理学部門

ジンジャー・L・ミルン

ヨーテボリ大学、ヨーテボリ、スウェーデン

トーマス・ニストロム

コペンハーゲン大学病院、コペンハーゲン、デンマーク

ヘンリック・E・ポールセン

共和国大学、モンテビデオ、ウルグアイ

ラファエル・ラディ

オクラホマ医学研究財団、米国オクラホマ州オクラホマシティ

ホリー・ヴァン・レンメン

ノースウェスタン大学、イリノイ州エバンストン、米国

ポール・T・シューマッカー

カタール生物医学研究所、ハマド・ビン・ハリファ大学、カタール財団、ドーハ、カタール

ポール・J・ソーナリー

名古屋大学大学院医学系研究科、名古屋

Shinya Toyokuni

オタゴ大学、クライストチャーチ、ニュージーランド、病理学・生物医学学部

クリスティーン・C・ウィンターボーン

中国科学院、上海栄養健康研究所、上海、中国

イン・フイヨン

シンガポール国立大学生化学・生命科学研究所神経生物学プログラム、シンガポール、シンガポール

バリー・ハリウェル

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この合意声明の最初のきっかけは、初期バージョンと最終バージョンの両方を作成した BH と MPM から来ました。 HB、VB、CJC、KJAD、MJD、TPD、TF、HJF、YJ-H.、DG、VEK、BK、N.-GL、GLM、TN、HEP、RR、HVR、PTS、PJT、ST、CCW、およびHY は原稿の一部を書き、原稿全体を編集して承認しました。

マイケル・P・マーフィーまたはバリー・ハリウェルとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Metabolism は、この研究の査読に対する Liron Bar-Peled、Kathy Griendling、Pietro Ghezzi の貢献に感謝します。主な取り扱い編集者: Christoph Schmitt、Nature Metabolism チームと協力。

転載と許可

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受信日: 2022 年 1 月 14 日

受理日: 2022 年 5 月 19 日

公開日: 2022 年 6 月 27 日

発行日：2022年6月

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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