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Nov 30, 2023

マラリア蚊は牛の尿を獲得して分配し、生活史形質を強化する

giornale della malaria

Malaria Journal volume 21、記事番号: 180 (2022) この記事を引用

1507 アクセス

2 引用

22 オルトメトリック

メトリクスの詳細

栄養素の獲得と配分は、昆虫の採餌と生活史の特性を統合します。 さまざまな生活段階での特定の栄養素の不足を補うために、昆虫は代かきとして知られる過程で、脊椎動物の分泌物などを補食することによってこれらを獲得することがあります。 蚊のハマダラカは栄養不足で出現するため、代謝と生殖の両方に栄養素を必要とします。 この研究の目的は、An かどうかを評価することでした。 アラビエンシスは、生活史形質を改善するために栄養を得るためにウシの尿をかき混ぜます。

Anかどうかを判断します。 アラビエンシスは、生後24時間、72時間、168時間経過した牛の新鮮な尿の匂いに誘引され、宿主を求めて採血した雌（採血後48時間）をY字管嗅覚計で検査し、妊娠中の雌を評価した。産卵アッセイで。 その後、化学分析と電気生理学的分析を組み合わせて、牛の尿の 4 つの年齢クラスすべての生理活性化合物を特定しました。 生理活性化合物の合成ブレンドは、Y チューブ アッセイとフィールド アッセイの両方で評価されました。 牛の尿とその主な窒素化合物である尿素をマラリア媒介動物の補助食としての可能性を調査するために、摂食パラメータと生活史形質を測定しました。 メスの蚊の割合と、吸収された牛の尿と尿素の量が評価されました。 給餌後、雌の生存、繋留飛行、繁殖について評価しました。

ホストを求め、血を注ぐアン。 アラビエンシスは、実験室と野外研究の両方で、新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿の自然な匂いと合成の匂いに惹かれました。 妊娠中の雌は、産卵場所での牛の尿の存在に対して無関心でした。 宿主を求め、吸血された雌は牛の尿と尿素を積極的に摂取し、生理学的状態に応じて、飛行、生存、生殖に対する生活史のトレードオフに従ってこれらの資源を割り当てました。

ハマダラカハマダラカは、生活史形質を改善するためにウシの尿を取得して割り当てます。 牛の尿の補助給餌は、1 日の生存率と媒介密度の増加によって直接的に媒介能力に影響を与えるだけでなく、飛行活動の変化によって間接的にも影響を与えるため、将来のモデルでは考慮される必要があります。

栄養素の獲得と配分は、昆虫の採餌と生活史の形質を統合します[1、2、3]。 昆虫は、食物の入手可能性と栄養素の必要性に応じて、餌を選択して獲得し、代償摂食することができます[1、3]。 栄養素の配分は生活史のプロセスに依存しており、昆虫のさまざまな生活段階で食餌の質と量のニーズが異なる可能性があります[1、2]。 特定の栄養素の不足を補うために、昆虫は代かきと呼ばれるプロセスで、泥、脊椎動物のさまざまな排泄物や分泌物、腐肉などを補食することによってこれらを獲得することがあります[2]。 主にさまざまな蝶や蛾の種について説明されていますが、水たまりは他の昆虫の目でも発生し、これらの種類の資源への誘引と摂食は、適応度やその他の生活史形質に重大な影響を与えます [2、4、5、6、7] ]。 マラリア蚊、ハマダラカ Anopheles gambiae sensu lato (sl) は、「栄養不足」の成虫として羽化します [8]。そのため、代かきはその生活史特性にとって重要な役割を果たしている可能性がありますが、これまでのところその行動は知られていません。見落とされた。 この重要な媒介動物の栄養摂取を高める手段として代かきを含めることは、重要な疫学的結果をもたらす可能性があるため注意が必要です。

幼虫の段階から引き継がれるカロリー貯蔵量が少なく、血液粉の利用効率が低いため[9]、雌のマラリア蚊成虫の窒素摂取量は限られています。 女性のアン。 ガンビエ sl は、追加の血液食事を摂取することでこれを補うことが多く [10、11]、それによってより多くの人が病気にかかるリスクにさらされ、蚊の捕食リスクが増加します。 あるいは、他の昆虫で実証されているように、蚊は脊椎動物の排泄物を補助的に摂食して窒素化合物を獲得し、フィットネスと飛行の機動性を高めることができます[2]。 この点で、An 内の兄弟種の 1 つが持つ強力で異なる魅力。 ガンビエ sl 種複合体、ハマダラカ アラビエンシスと、新鮮で老化した牛の尿 [12、13、14] は興味深いものです。 ハマダラカは日和見的に宿主を好み、牛と共生し、牛を食べることがよく知られています。 牛の尿は窒素化合物が豊富な資源であり、尿素は新鮮な尿中の全窒素の 50 ～ 95% を占めています [15、16]。 牛の尿が老化すると、微生物がこれらの資源を利用し、それによって窒素含有化合物の複雑さが 24 時間以内に減少します [15]。 有機窒素の減少と相関してアンモニアが急速に増加すると、その多くが蚊に有毒な化合物を生成する好アルカリ性微生物が繁殖し[15]、これが女性のアンが発生する主な原因である可能性があります。 アラビエンシスは、24 時間以内に熟成された尿に優先的に誘引されます [13、14]。

この研究では、宿主を探し、血液を与えられたアン。 アラビエンシスは、最初の性腺栄養サイクル中に、尿のたまりを通じて尿素を含む窒素化合物を獲得するかどうかについて評価されました。 次に、メスの蚊が生存、繁殖、さらなる採食を強化するためにこの潜在的な栄養資源をどのように配分するかを評価する一連の実験が行われました。 最後に、新鮮な牛の尿と老化した牛の尿の匂いを評価して、これらの匂いが宿主を探し、血液を与えられるアンにとって信頼できる手がかりとなるかどうかを判定しました。 この潜在的な栄養資源の探索においてアラビエンシスを研究し、観察された異なる誘引力の根底にある化学物質が同定された。 24 時間熟成した尿で確認された揮発性有機化合物 (VOC) の合成臭気混合物を野外条件下でさらに評価し、実験室条件下で得られた結果を拡張し、異なる生理学的状態の蚊を誘引する牛の尿臭の有効性を実証しました。 得られた結果により、An. アラビエンシスは、脊椎動物の尿に含まれる窒素化合物を獲得して割り当て、生活史形質に影響を与えます。 これらの結果は、潜在的な疫学的な影響と、これらの結果がベクターの監視と制御にどのように使用されるかという文脈で議論されています。

ハマダラカハマダラカ（ドンゴラ株）を２５±２℃、６５±５％ＲＨ、１２：１２時間の明暗サイクルで維持した。 幼虫は、蒸留水を満たしたプラスチックトレイ (20 cm × 18 cm × 7 cm) で飼育し、Tetramin® フィッシュフード (Tetra Werke、デラウェア州メレ) を与えました。 蛹を 30 ml カップ (Nolato Hertila、オーストルプ、SE) に収集し、成虫が羽化するために Bugdorm ケージ (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science、台中、TW) に移しました。 成虫には、羽化後 4 日（dpe）まで 10% スクロース溶液を自由に与え、その時点で宿主を求める雌には直ちに餌を与えるか、記載されているように実験前に蒸留水を与えて一晩絶食させました。下に。 フライトチューブ実験に使用されたメスは、水を自由に摂取できる状態で、4～6時間だけ飢餓状態にさせられました。 その後のバイオアッセイ用に吸血蚊を準備するために、膜給餌システム (Hemotek Discovery Workshops、アクリントン、英国) を使用して、4 匹の dpe メスに脱繊維羊の血液 (Håtunalab、ブロ、サウスイースト) が提供されました。 完全に満腹した雌をその後別のケージに移し、下記の実験の前に、下記のように直接食餌を与えるか、または１０％スクロースを３日間自由に摂取させた。 後者の雌はフライトチューブバイオアッセイに使用され、実験室に移され、実験の 4 ～ 6 時間前に蒸留水を自由に摂取させて絶食させた。

摂食アッセイを使用して、成人の An による尿と尿素の消費量を定量化しました。 アラビエンシスのメス。 宿主を求め、血液を与えられた雌には、新鮮な牛と高齢の牛の尿の1%希釈、さまざまな濃度の尿素、および2つの対照、10%スクロースと水を含む餌が48時間与えられた。 さらに、食品着色料（1 mg ml-1 キシレンシアノール FF、CAS 2650-17-1、Sigma-Aldrich、ストックホルム、SE）を食餌に添加し、250 μl 微量遠心管の 4 × 4 マトリックスに入れて提供しました。 (Axygen Scientific、米国カリフォルニア州ユニオンシティ、図 1A) を縁まで満たします (約 300 μl)。 蚊間の競争と染料の色の潜在的な影響を避けるために、10 匹の蚊を大きなペトリ皿 (直径 12 cm、高さ 6 cm; Semadeni、Ostermundigen、CH、図 1A) に入れ、25 ± 2 の完全な暗闇に置きました。 ℃、相対湿度 65 ± 5%。 これらの実験は 5 ～ 10 回繰り返されました。 餌に曝露した後、さらなる分析まで蚊を -20 °C に置きました。

宿主を求めて吸血されたメスのハマダラカハマダラカによって摂取された牛の尿と尿素。 給餌アッセイ (A) では、メスの蚊に新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース (10%)、および蒸留水 (H2O) からなる餌を与えました。 宿主を求める雌 (B) と吸血雌 (C) は、試験した他のどの餌よりも大量のスクロースを摂取しました。 宿主を求める雌は、168 時間齢の牛の尿よりも 72 時間齢の牛の尿の摂取量が少ないことに注意してください (B)。 尿の平均総窒素含有量 (± 標準偏差) が挿入図に示されています。 尿素は、宿主を求める雌 (D、F) と吸血雌 (E、G) に用量依存的に摂取されました。 異なる文字指定による平均摂取量 (D、E) は、互いに大きく異なります (Tukey の事後分析による一元配置分散分析; p < 0.05)。 エラーバーは平均値の標準誤差 (B ～ E) を表します。 直線の点線は対数線形回帰直線 (F、G) を表します。

吸収された餌を放出するために、蚊を 230 μl の蒸留水が入った 1.5 ml 微量遠心管に個別に入れ、使い捨て乳棒とコードレスモーター (VWR International、ルンド、SE) を使用して組織を破砕し、10 krpm で 10 分間遠心分離しました。分。 上清 (200 μl) を 96 ウェルマイクロプレート (Sigma-Aldrich) に移し、分光光度計ベースのマイクロプレートリーダー (SPECTROStar® Nano、BMG Labtech、Ortenberg、DE) を使用して吸光度 (λ620 nm) を測定しました。 あるいは、蚊を1 mlの蒸留水中で粉砕し、その900 μlを分光光度分析（λ620 nm; UV 1800、Shimadzu、Kista、SE）用のキュベットに移した。 摂取した食事を定量するために、0.2 μl ～ 2.4 μl の範囲の 1 mg ml-1 キシレン シアノールとなる段階希釈によって標準曲線を作成しました。 次に、既知の染料濃度の光学濃度を使用して、各蚊が吸収した餌の量を決定しました。

体積データは、一元配置分散分析 (ANOVA) とその後の Tukey の事後一対比較を使用して分析されました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.、米国ノースカロライナ州ケアリー、1989 ～ 2007)。 線形回帰分析により、濃度依存性の尿素摂取量が記述され、宿主探索蚊と吸血蚊の反応が比較されました（Mac 用 GraphPad Prism v8.0.0、GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）。

各年齢カテゴリーからのサンプル尿約 20 μl を Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 メッシュ、Sigma Aldrich) に結合させ、錫カプセル (8 mm × 5 mm) に封入しました。 このカプセルを CHNS/O 分析装置 (Flash 2000、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) の燃焼室に挿入し、メーカーのプロトコールに従って、新鮮な尿と老化した尿の窒素含有量を測定しました。 全窒素 (g N l-1) は、標準として使用される既知の濃度の尿素に基づいて定量されました。

宿主を求めて吸血されたメスの生存に対する食事の影響を評価するために、蚊を個別に大きなペトリ皿（直径 12 cm、高さ 6 cm、Semadeni）に入れ、蓋にメッシュで覆われた穴（3 cm）を付けました。直径）換気と食事の提供のため。 新鮮な牛尿と高齢牛の尿の 1% 希釈、4 つの濃度の尿素、および 2 つの対照、10% スクロースと水からなる食餌を、4 dpe の直後に与えました。 各食餌を、5 ml シリンジ (Thermo Fisher Scientific、ヨーテボリ、SE) に挿入された歯科用コットン ロール (DAB Dental AB、SE、Upplands Väsby、SE) 上にピペットで移し、プランジャーを取り外し、ペトリ皿の上に置きました (図 2)。 1A）。 食餌は毎日置き換えた。 実験室は上記のように維持されました。 最後の蚊が死ぬまで、死んだ蚊を捨てながら、生き残った蚊を毎日２回数えた（処理当たりｎ＝４０）。 それぞれの食餌を摂食する蚊の生存は、食餌間の生存分布比較のためのカプラン・マイヤー生存曲線およびログランク検定統計（IBM SPSS Statistics 24.0.0.0）を使用して分析されました。

Attisano et al. に基づいたカスタムメイドの蚊飛行ミル。 [17] は、前面パネルと背面パネルのない、厚さ 5 mm の透明なアクリル パネル (幅 10 cm × 長さ 10 cm × 高さ 10 cm) で作られました (図 3: 上)。 ガスクロマトグラフィーカラム (内径 0.25 mm、長さ 7.5 cm) を両端で昆虫ピンに接着して構成した垂直チューブを備えたピボット アセンブリを、9 cm 離れた一対のネオジム磁石の間に吊り下げました。 同じ素材 (長さ 6.5 cm) で作られた水平チューブが垂直チューブを二分し、テザリング アームと、光遮断信号としてアルミ箔の小片を運ぶアームを作成しました。

つなぐ前に、24 時間絶食させたメスに上記の餌を 30 分間与えました。 次に、十分に餌を与えたメスの蚊を個別に氷上で 2 ～ 3 分間麻酔し、中胸部の蜜蝋 (Joel Svenssons Vaxfabrik AB、南東部ムンカ リュングビー) を使用して昆虫ピンに接着し、次に蚊の水平チューブのアームに繋ぎ止めました。フライトミル。 各飛行回転はカスタマイズされたデータ ロガーによって記録され、PC-Lab 2000™ ソフトウェア (v4.01; Velleman、Gavere、BE) を使用して保存および表示されました。 フライトミルは、空調された部屋 (12 時間: 12 時間、明: 暗、25 ± 2 °C、65 ± 5% RH) に置かれました。

飛行活動のパターンを視覚化するために、総飛行距離 (m) と連続飛行活動の総発作回数が 24 時間にわたって 1 時間ごとに計算されました。 さらに、個々の女性の平均飛行距離がさまざまな治療法間で比較され、一元配置分散分析とそれに続く Tukey 事後分析 (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.) を使用して分析されました。平均距離は従属変数とみなされ、治療法は独立因子と考えられました。 さらに、平均試合数は 10 分単位で計算されました。

アンの生殖能力に対する食事の影響を評価する。 arabiensis では、6 匹の雌 (4 dpe) を吸血直後にバグドーム ケージ (30 cm × 30 cm × 30 cm) に移し、その後、上記の実験食を 48 時間与えました。 次に餌を取り除き、20 mlの蒸留水を満たした産卵カップ（30 ml; Nolato Hertila）を3日目に提供し、24時間ごとにカップを交換して48時間使用できるようにした。 それぞれの食事療法を 20 ～ 50 回繰り返しました。 卵の数を数え、実験用ケージごとに記録しました。 ライカカメラ (DFC) を備えた Dialux-20 顕微鏡 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar、デラウェア州ウェッツラー) を使用して、卵のサブサンプルを使用して、個々の卵の平均サイズと長さのばらつき (食餌ごとに n ≥ 200) を評価しました。 320 R2、ライカ マイクロシステム社、デラウェア州）。 残りの卵は、標準飼育条件下で温度管理されたチャンバー内で 24 時間維持し、最近羽化した 1 齢幼虫 (食餌あたり n ≧ 200) のサブサンプルを上記のように測定しました。 卵の数、および卵と幼虫の両方のサイズをさまざまな処理間で比較し、一元配置分散分析とそれに続く Tukey 事後分析を使用して分析しました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc) 。）。

新鮮（サンプリング後 1 時間）、24 時間、72 時間、および 168 時間経過した尿からのヘッドスペース揮発性物質を、アルシ族のゼブ牛から収集したサンプルから収集しました。 利便性と入手しやすさを考慮して、尿サンプルの収集は牛がまだ小屋にいる早朝に行われました。 尿サンプルは 10 人から採取され、各サンプル 100 ～ 200 ml が、蓋付き 3 L ポリ塩化ビニル プラスチック バケツの中に置かれた別々のポリアミド ロースト バッグ (Toppits Cofresco、Frischhalteprodukte GmbH and Co.、デラウェア州ミンデン) に移されました。 個々の牛の尿サンプルからのヘッドスペース揮発性物質は、直接（新鮮）、または室温で 24 時間、72 時間、および 168 時間の熟成後に収集されました。つまり、各尿サンプルは各年齢グループで表されました。

ヘッドスペースの揮発性物質の収集には、ダイアフラム真空ポンプ (KNF Neuberger、デラウェア州フライブルク) を使用して、活性炭で濾過した空気流 (100 ml min-1) をポリアミドバッグを通して吸着剤カラム上に循環させる閉ループシステムを使用しました。 、2.5時間。 対照として、空のポリアミドバッグからのヘッドスペース収集を実施した。 吸着剤カラムは、グラスウールプラグの間に 35 mg の Porapak Q (50/80 メッシュ; Waters Associates、米国マサチューセッツ州ミルフォード) を保持するテフロンチューブ (5.5 cm × 内径 3 mm) で作成しました。 カラムは、使用前に１ｍｌの再蒸留ｎ－ヘキサン（メルク、ダルムシュタット、デラウェア州）および１ｍｌのペンタン（９９．０％純度溶媒ＧＣグレード、シグマアルドリッチ）ですすいだ。 吸着した揮発性物質を400μlのペンタンで溶出した。 ヘッドスペースコレクションをプールし、さらなる分析に使用するまで -20 °C で保存しました。

宿主を探し、血液を与えられた An の行動反応。 新鮮な、24 時間、72 時間、および 168 時間経過した尿から収集されたヘッドスペースへのアラビエンシス蚊の揮発性抽出物を、直管ガラス管嗅覚計を使用して分析しました [18]。 実験は、An の宿主探索活動のピーク期間である ZT 13 ～ 15 の間に行われました。 アラビエンシス [19]。 ガラス管嗅覚計（内径 80 cm × 9.5 cm）を上から 3 ± 1 lx の赤色光で照明しました。 木炭で濾過し、加湿した空気流 (25 ± 2 °C、相対湿度 65 ± 2%) を 30 cm s-1 でバイオアッセイに通過させました。 空気は一連のステンレス鋼メッシュスクリーンを通過し、層流と均一なプルーム構造を生成しました。 嗅覚計の風上端にある 5 cm のワイヤー コイルから吊り下げられた歯科用コットン ロール ディスペンサー (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB) を使用し、刺激を 5 分ごとに交換しました。 分析には、1:10 希釈の各ヘッドスペース抽出物 10 μl を刺激として使用しました。 等量のペンタンを対照として使用した。 実験開始の 2 ～ 3 時間前に、個々の宿主探索蚊または吸血蚊を別々の放鳥ケージに入れました。 放出ケージを嗅覚計の風下端に置き、蚊を 1 分間順応させた後、放出のためにケージのバタフライ バルブを開けました。 治療または対照への誘引は、放出後 5 分以内に発生源に接触した蚊の割合として分析されました。 各ヘッドスペース揮発性抽出物とコントロールを少なくとも 30 回繰り返し、日による影響を避けるために、各実験日に同じ数の処理とコントロールをテストしました。 宿主を求め、血を与えられたアンの反応。 ヘッドスペースコレクションに対するアラビエンシスは、名目ロジスティック回帰に続いてオッズ比の一対比較を使用して分析されました（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）。

Anの産卵反応。 アラビエンシスと新鮮牛および熟成牛の尿のヘッドスペース抽出物をバグドームケージ (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) で分析しました。 ２０ｍｌの蒸留水を満たしたプラスチックカップ（３０ｍｌ；Ｎｏｌａｔｏ Ｈｅｒｔｉｌａ）を産卵基質とし、２４ｃｍ離してケージの対向隅に置いた。 処理カップを、1:10 希釈の各ヘッドスペース抽出物 10 μl で調整しました。 等量のペンタンを使用して対照カップを調整した。 位置効果を制御するために、各実験の間に治療カップと対照カップを交換しました。 血液を与えられた雌 10 匹が ZT 9 ～ 11 の実験ケージに放され、24 時間後にカップ内の卵の数が数えられました。 産卵指数は、(処理カップに産まれた卵の数 – 対照カップに産まれた卵の数)/(卵の総数)によって計算されました。 各処理を 8 回繰り返しました。

メスの An のガスクロマトグラフィーと電気アンテナ検出器 (GC-EAD) を組み合わせた分析。 arabiensis は以前に記載されているように実行されました [20]。 簡単に説明すると、HP-5 カラム (内径 30 m × 0.25 mm、膜厚 0.25 μm、Agilent Technologies) を備えた Agilent Technologies 6890 GC (米国カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、新鮮な抽出物のヘッドスペース揮発性抽出物を分離しました。そして古くなった尿。 移動相として水素を平均線流速 45 cm s-1 で使用しました。 各サンプル (2 μl) を、インジェクター温度 225 °C でスプリットレス モードで 30 秒間注入しました。 GC オーブンの温度は、35 °C (3 分間保持)、10 °C min-1 から 300 °C (10 分間保持) までプログラムされました。 GC 流出液スプリッターでは、4 psi の窒素が追加され、Gerstel 3D/2 低デッドボリューム 4 方向クロス (Gerstel、デラウェア州ミュルハイム) で炎イオン化検出器と EAD の間で 1:1 に分割されました。 EAD の GC 流出液キャピラリーは、GC オーブン温度プラス 5 °C を追跡する Gerstel ODP-2 移送ラインを通過し、ガラス管 (10 cm × 8 mm) に入り、そこで木炭で濾過され、加湿された液体と混合されました。空気 (1.5 l min−1)。 アンテナはこのチューブの出口から 0.5 cm の位置に配置されました。 個々の蚊はそれぞれ 1 回の反復を占め、宿主を求める蚊については尿サンプルの年齢ごとに少なくとも 3 回の反復が行われました。

GC-EAD 分析で触角反応を誘発する、新鮮な牛尿と高齢牛の尿のヘッドスペース収集中の生理活性化合物は、GC と質量分析計 (GC-MS、6890 GC および 5975 MS、Agilent Technologies) を組み合わせて同定されました。 70 eVの電子衝撃イオン化モードで。 GC には HP-5MS UI コーティングされたフューズドシリカキャピラリーカラム (60 m × 内径 0.25 mm、膜厚 0.25 μm) が装備されており、ヘリウムを平均線流速 35 cm s-1 で移動相として使用しました。 GC-EAD 分析と同じインジェクター設定とオーブン温度を使用して、2 μl のサンプルを注入しました。 化合物は、カスタムメイドおよび NIST14 ライブラリー (Agilent) と比較して、保持時間 (Kovát 指数) および質量スペクトルに従って同定されました。 同定された化合物は、本物の標準物質を注入することによって確認されました (追加ファイル 1: 表 S2)。 定量化のために、酢酸ヘプチル (10 ng、化学純度 99.8%、Aldrich) を外部標準として注入しました。

新鮮な尿と古い尿で同定された生理活性化合物で構成される合成臭気混合物の、宿主を求めるアンや吸血アンを誘引する効果を評価する。 arabiensis では、上記と同じ嗅覚計およびプロトコルを使用しました。 合成ブレンドは、新鮮、24 時間、48 時間、72 時間および 168 時間経過した尿のプールされたヘッドスペース揮発性抽出物中の化合物の組成と比率を模倣しました（図 5D–G; 追加ファイル 1: 表 S2）。 分析では、全合成ブレンドの 1:100 希釈液 10 μl を、全体の放出速度が約 140 ～ 2400 ng h-1 の範囲で使用し、宿主を求める蚊と吸血蚊の誘引性を評価しました。 その後、完全ブレンドから単一化合物を除去したサブトラクティブ ブレンドを完全ブレンドに対してテストしました。 宿主を求め、血を与えられたアンの反応。 合成ブレンドおよび減算ブレンドに対するアラビエンシスの比率を、名目ロジスティック回帰とその後のオッズ比の一対比較を使用して分析しました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.)。

牛の尿がマラリア蚊の宿主生息地の合図となるかどうかを評価するために、上記のように収集した新鮮な牛の尿と高齢の牛の尿と水を、側面に穴が開いたメッシュで覆われた 3 リットルのバケツ (100 ml) に入れ、セットしました。宿主デコイトラップ（BG-HDTバージョン；BioGents、レーゲンスブルク、デラウェア州）の上に。 10個のわなは、村落コミュニティ（エチオピア、シレ、北緯5度53度24度、東経37度29度24度）から400メートル離れた牧草地に50メートル離れて設置され、牛のいない場所に設置されました。恒久的な繁殖地と村。 5 つのトラップは宿主の存在をシミュレートするために加熱され、5 つのトラップは加熱されませんでした。 各治療の位置は毎晩ローテーションされ、合計5晩行われました。 異なる年齢の尿を餌としたトラップに捕獲された蚊の数の比較は、ベータ二項分布によるロジスティック回帰を使用して行われました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.)。

エチオピアのオロミア地方（北緯8度11分08秒、北緯38度81分）のメキ町近くのマラリア常在村で、野外で野生の蚊を誘引する合成24時間牛尿臭ブレンドの有効性が評価されました。 70インチE、図6A）。 この研究は、長雨期に合わせて、毎年屋内残留散布が行われる前の8月中旬から9月中旬にかけて実施された。 村の周縁部に位置する 5 組の家（20 ～ 50 m 離れた）が研究のために選択されました（図 6A）。 住宅を選択するために使用された基準は、家の中で動物を飼うことが許可されていないこと、屋内での調理（薪または炭の喫煙）が許可されていないこと（少なくとも試用期間中）、および最大 2 人の住民が就寝できる住宅であることです。殺虫剤処理されていない蚊帳の下で。 倫理的承認は、世界医師会ヘルシンキ宣言によって定められたガイドラインに従って、アディスアベバ大学自然科学部機関研究倫理審査委員会 (CNS-IRB) (IRB/022/2016) から得られました。 保健普及員の協力を得て各世帯主の同意を得た。 このプロセス全体は、地区および区（「ケベレ」）レベルの地方行政によって承認されました。 実験計画は 2 × 2 のラテン方陣計画に従い、最初の夜に合成ブレンドと対照をペアのハウスに割り当て、次の実験の夜にハウス間で交換しました。 この手順を 10 回繰り返しました。 さらに、選択した家屋における蚊の活動を推定するために、合成ブレンドディスペンサーを使用しない CDC トラップを、5 日間にわたる野外試験の開始時、中間時、終了時に 1 日の同じ時間帯に作動するように設定しました。

6 つの生理活性化合物を自然な比率 (7:9:156:156:1:4; 図 5D-G; 追加ファイル 1: 表 S2) で含む合成ブレンドをヘプタン (97.0% 溶媒 GC グレード、 Sigma Aldrich)、綿芯ディスペンサーを使用して 140 ng h-1 で放出されました [20]。 芯ディスペンサーにより、12 時間の実験を通じてすべての化合物を一定の割合で放出できます。 ヘプタンを対照として使用した。 バイアルは、疾病管理予防センター（CDC）ライトトラップ（米国フロリダ州ゲインズビルの John W. Hock Company）の入口ポイントの隣に吊り下げられました。 トラップはベッドの足側の隣の地面から 0.8 ～ 1 m の高さで吊り下げられ、ボランティアは未処理の蚊帳の下で就寝し、18 時から 6 時 30 分まで作動しました。 捕獲された蚊は、性別および生理学的状態 (摂食されていない、摂食されている、半妊娠中および妊娠中 [21]) によって分類されました。その後、蚊は形態学的に種 [9, 22] に同定され、乾燥シリカゲルを備えた 1.5 ml 微量遠心管に入れられました。その後、形態学的に An. gambiae sl と同定された蚊の % をポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 分析を使用してスクリーニングし、種複合体のメンバーを同定しました [23]。フィールド調査では、対になったハウスのわな捕獲を名目ロジスティックフィットモデルを使用して分析しました。このモデルでは、誘引力が従属変数であり、処理（合成ブレンド対対照）が固定効果です（JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.）。ここでは、尤度比検定からの χ2 と p 値を報告します。

An かどうかを評価します。 アラビエンシスは、直接給餌を通じて尿とその主な窒素源である尿素を獲得することができ、出芽後4日（dpe）の宿主探索と血液給餌の雌に、48時間にわたってこれらの食餌を与えることができました。摂食アッセイ (図 1A)。 宿主探索雌と吸血雌はどちらも、他の餌や水よりも有意に多量のスクロースを摂取しました（それぞれ、F(5,426) = 20.15、p < 0.0001 および F(5,299) = 56.00、p < 0.0001。図1B、C）。 さらに、宿主を求める雌は、168 時間経過した尿と比較して、72 時間経過した尿の方が摂食量が少なくなりました (図 1B)。 尿素を含む餌を与えると、宿主を求める雌は他のすべての濃度と水と比較して有意に多量の 2.69 mM 尿素を摂取しましたが、10% スクロースと変わらなかった (F(10,813) = 15.72、p < 0.0001、図 1D) ）。 これは、10%スクロースに比べて著しく少量の尿素含有飼料を摂取するものの、通常、水に比べて有意に多量の尿素含有飼料を摂取する血液給餌メスの反応とは異なっていた(F(10,557) = 78.35、p < 0.0001;図1)。 1E）。 さらに、2 つの生理学的状態を比較すると、吸血メスは宿主を求めるメスよりも最低濃度でより多くの尿素を摂取しましたが、これらのメスは高濃度でも同量の尿素を摂取しました (F(1,953) = 78.82、p < 0.0001;図. 1F、G）。 尿素含有食の摂取量には最適値があるように見えますが（図 1D、E）、両方の生理学的状態の女性は、尿素濃度の全範囲にわたって対数線形で尿素摂取量を調節できました。ファッション（図1F、G）。 同様に、尿中の窒素量が吸収される量に反映されるため、蚊は吸収される尿の量を調節することによって窒素の摂取を制御しているようです（図1B、C、およびB挿入図）。

宿主を求める蚊と吸血蚊の生存における尿と尿素の役割を評価するために、メスに 4 つの年齢すべての尿 (新鮮、付着後 24 時間、72 時間、および 168 時間) と一定範囲の尿素を与えました。同様に、蒸留水と 10% スクロースを対照として使用しました (図 2A)。 この生存分析により、食事が宿主を求める雌の全生存率に有意な影響を与えていることが明らかになりました（尿：χ2 = 108.5、df = 5、p < 0.0001、尿素：χ2 = 122.8、df = 5、p < 0.0001、図２Ｂ、Ｃ）および血液を与えられた雌（尿：χ２＝９３．０、ｄｆ＝５、ｐ＜０．０００１；尿素：χ２＝１３７．９、ｄｆ＝５、ｐ＜０．０００１；図２Ｄ、Ｅ）。 すべての実験において、尿、尿素、水を摂取した雌は、餌としてスクロースを摂取した雌に比べて生存率が大幅に低下しました（図2B～E）。 新鮮な尿と古い尿を摂食する宿主探索雌は生存率に差があり、72 時間経った尿を摂食する雌は生存確率が最も低かった (p = 0.016) (図 2B)。 さらに、135 mM 尿素を与えられた宿主探索雌は、水対照よりも長く生存しました (p < 0.04) (図 2C)。 血液を与えられた雌は、水と比較して、新鮮な尿と 24 時間熟成した尿を与えられた場合に長く生存しました (それぞれ p = 0.001 および p = 0.012、図 2D)。一方、72 時間熟成した尿を与えられた雌は、与えられた雌よりも生存期間が短くなりました。新鮮な尿と 24 時間経った尿について (それぞれ p < 0.0001 および p = 0.013; 図 2D)。 135 mM 尿素を与えた場合、吸血メスは他の濃度の尿素と水よりも長く生存しました (p < 0.013; 図 2E)。

宿主を求め、牛の尿と尿素を餌として吸血するメスのハマダラカの生存。 バイオアッセイ (A) では、メスの蚊に、新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース (10%)、および蒸留水 (H2O) からなる餌を与えました。 宿主を求める個々の蚊 (B、C) と吸血蚊 (D、E) の生存率を、すべてのメスが尿 (B、D) と尿素 (C、E) を食べるまで 12 時間ごとに記録しました。対照であるスクロースと水は死んでいました

24時間にわたるフライトミルアッセイで測定した総距離と発作回数は、宿主探索蚊と吸血蚊では異なり、吸血蚊は全体的に飛行活動が少なかった（図3）。 新鮮な尿と熟成した尿、またはショ糖と水を与えられた宿主を求める蚊は、さまざまな飛行パターンを示し（図3）、新鮮な尿を与えられたメスは夜明けにより活発になり、24時間および168時間熟成された尿を与えられたメスは活発な行動を示した（図3）。主に日中の活動。 スクロースまたは72時間熟成した尿を与えられたメスの蚊は24時間を通して活動を示しましたが、水を与えられたメスの蚊は暗点相中期により活発でした。 スクロースを食べた蚊は深夜と早朝に最も高い活動レベルを示しましたが、72時間熟成した尿を吸った蚊は24時間にわたって活動が着実に減少しました（図3）。

宿主を探し、牛の尿と尿素を与えて吸血したメスのハマダラカの飛行性能。 新鮮な牛と熟成した牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース（10％）、蒸留水（H2O）からなる餌を与えられたメスの蚊を、フライトミルアッセイの水平自由回転アームに繋ぎ止めました（上）。 宿主探索雌（左）と吸血雌（右）の両方について、食餌ごとに 24 時間にわたる 1 時間あたりの飛行総距離と発作回数（暗所相：灰色、光相：白色）を記録しました。 平均距離と平均試合数が日内活動プロットの右側に表示されます。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 統計分析については本文を参照してください

一般に、宿主を求めるメスによる飛行活動の全体的な動きは、24 時間の飛行距離と同様のパターンに従いました。 摂取した食事は平均飛行距離に有意な影響を及ぼし（F(5, 138) = 28.27、p < 0.0001）、宿主を求める雌は 72 時間熟成した尿を摂取したため、他のすべての食事よりも有意に長い距離を飛行しました（p < 0.0001）。スクロースを与えられた蚊は、新鮮な尿を与えられた蚊 (p = 0.022) および 24 時間熟成された尿を与えられた蚊 (p = 0.022) よりも長い距離を飛行しました。 尿食で説明された飛行活動パターンとは対照的に、尿素を与えられた宿主探索雌は、24 時間にわたって継続的な飛行活動を示し、活動のピークは暗期の後半にありました（図 3）。 活動のパターンは似ていましたが、尿素を与えられた宿主探索メスは、摂取した濃度に応じて平均飛行距離を大幅に延長しました（F(5, 138) = 1310.91、p < 0.0001）。 テストした任意の濃度の尿素を餌として宿主を求める雌は、水やショ糖を餌とした雌よりも長い距離を飛行しました（p < 0.03）。

吸血した蚊の全体的な飛行活動は、すべての食餌で 24 時間にわたって安定かつ継続的でしたが、水で給餌したメスと新鮮な蚊と 24 時間熟成させたものを給餌したメスでは暗転期の後半で活動が増加しました。尿（図3）。 尿食は、吸血雌の平均飛行距離に有意な影響を与えたが(F(5, 138) = 4.83、p = 0.0004)、尿素食には目立った影響はなかった(F(5, 138) = 1.36、p = 0.24)。 。 24 時間熟成させた尿を与えた血液飼育の雌のみが、他の尿および対照食と比較して平均飛距離の増加を示しました (新鮮、p = 0.0091; 72 時間、p = 0.0022; 168 時間、p = 0.001; スクロース、p = 0.0017; dH2O、p = 0.036)。

生殖パラメータに対する尿および尿素摂取の影響は、産卵生物検定法で評価され（図 4A）、雌あたりの産卵数、卵および新たに孵化した一齢幼虫のサイズの観点から調査されました。 アンが産んだ卵の数。 尿を与えられたアラビエンシスの雌は、食事によって変化した(F(5, 222) = 4.38、p = 0.0008、図4B)。 採血後の24時間熟成尿を与えられたメスは、他の尿餌を与えられた場合よりも有意に多くの卵を産み、スクロースを与えられたメスが産む卵と同様の卵を産んだ(図4B)。 同様に、尿を与えられたメスが産む卵のサイズは食事によって異なり（F(5, 209) = 12.85、p < 0.0001）、24 時間熟成した尿とスクロースを与えられたメスは水で与えられたメスよりも有意に大きな卵を産みました。一方、168時間熟成した尿を与えられたメスの卵は著しく小さかった（図4C）。 さらに、尿食餌は幼虫のサイズに有意な影響を及ぼし（F(5, 187) = 7.86、p < 0.0001）、24 時間および 72 時間熟成した尿を食べたメスが産んだ卵から出る幼虫は、メスの卵から出る幼虫よりも著しく大きかった。水で飼育され、尿で飼育された168時間齢の雌（図4D）。

牛の尿と尿素を餌としたメスハマダラカの繁殖成績。 血液を吸血した雌の蚊に、新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース（10％）、蒸留水（H2O）からなる餌を48時間にわたって与え、その後、産卵場所にアクセスできるバイオアッセイに設置しました。基質を 48 時間放置します (A)。 卵の数 (B、E)、卵の大きさ (C、F)、幼虫の大きさ (D、G) は、与えられた餌によって大きく影響されました (牛の尿: B ～ D、尿素: E ～ G)。 異なる文字指定で測定された各パラメーターの平均は、互いに大きく異なります (Tukey の事後分析による一元配置分散分析; p < 0.05)。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します

尿の主な窒素成分である尿素を、採血雌に餌として与えると、研究したすべての生殖パラメータに異なった有意な影響を与えました。 採血後の尿素を与えられた雌が産んだ卵の数は、尿素の濃度に応じて異なり（F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001）、尿素濃度が 134 μM ～ 1.34 mM の範囲で与えられた雌は、より多くの卵を産みます（図4E）。 134 μM 以上の濃度の尿素を与えられた雌は、水を与えられた雌よりも大きな卵を産みました (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; 図 4F)。一方、幼虫のサイズは、摂取した同様の濃度の尿素の影響を受けました。母親による影響 (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001) は、よりばらつきがありました (図 4G)。

宿主を求めるアンの牛の尿の揮発性抽出物がヘッドスペースに全体的に引き寄せられます。 ガラス管嗅覚計で評価したアラビエンシス（図５Ａ）は、尿の年齢によって顕著な影響を受けた（χ２＝１５．９、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００３２；図５Ｂ）。 事後分析により、24 時間経過した尿の臭気は、新鮮な尿の臭気 (p = 0.13; 図 5B)。 吸血蚊による尿臭に対する全体的な誘引力には有意差はなかったが（χ2 = 8.78、df = 4、p = 0.067、図 5C）、これらのメスはヘッドスペースの揮発性抽出物により有意に誘引されることが判明した。 72 時間経過した尿の対照との比較 (p = 0.0066、図 5C)。

天然および合成の牛の尿臭に対する、宿主を求めて吸血するハマダラカハマダラカの行動反応。 ガラス管嗅覚計の図 (A)。 宿主を求める蚊 (B) と吸血した蚊 (C) の新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿のヘッドスペースへの揮発性抽出物への誘引。 宿主を求める An の触角反応。 新鮮な牛の尿 (D)、24 時間 (E)、72 時間 (F) および 168 時間 (G) の熟成牛の尿からの分別されたヘッドスペース抽出物に対するアラビエンシスが示されています。 電気アンテナグラフ検出 (EAD) トレースは、ガスクロマトグラフから溶出し、炎イオン化検出器 (FID) によって検出されるヘッドスペース内の生物活性化合物に応じた電圧変化を示します。 スケールバーは、応答の振幅 (mV) と保持時間 (秒) の関係を示します。 生理活性化合物の正体と放出速度 (μg h-1) が示されています。 単一のアスタリスク (*) は、一貫した低振幅応答を示します。 二重アスタリスク (**) は再現不可能な応答を示します。 宿主を求める（H）、血を養う（I）アン。 アラビエンシスは、新鮮な牛と熟成した牛の尿の匂いの合成混合物に異なって誘引されます。 異なる文字指定で誘引される蚊の平均割合は、互いに大きく異なります (Tukey の事後分析による一元配置分散分析; p < 0.05)。 エラーバーは割合の標準誤差を示します。

女性のアン。 採血後 72 時間および 120 時間のアラビエンシスは、産卵中にペンタン対照よりも新鮮な牛尿と熟成牛尿のヘッドスペース揮発性抽出物を好むことを示さなかった（χ2 = 3.07、p > 0.05; 追加ファイル 1: 図.S1)。

女性アンの場合。 arabiensis の場合、GC-EAD および GC-MS 分析により、新鮮、24 時間、72 時間、および 168 時間の熟成牛尿のヘッドスペース揮発性抽出物中にそれぞれ 8、6、3 および 3 つの生理活性化合物が同定されました（図 5D–G）。 電気生理学的反応を誘発する化合物の数に観察された違いにもかかわらず、これらの化合物の大部分は、新鮮な尿と古い尿から収集されたヘッドスペースの揮発性抽出物のそれぞれに存在していました。 したがって、各抽出物について、メスの触角から閾値を超える生理学的反応を生じた化合物のみがさらなる分析に含まれました。

ヘッドスペースコレクション内の生理活性化合物の総揮発性放出速度は、主に p- クレゾールと m-クレゾールの増加により、新鮮な尿の 29 μg h-1 から 168 時間経過した尿の 242 μg h-1 に増加しました。フェノールとして。 対照的に、他の化合物（2-シクロヘキセン-1-オンやデカナールなど）の放出速度は、尿の年齢が増すにつれて減少し、クロマトグラムで観察されたシグナル強度（存在量）の減少と相関していました（図5D）。 –G 左パネル）およびこれらの化合物に対する生理学的反応（図 5D-G 右パネル）。

全体として、新鮮な尿と古い尿のヘッドスペース揮発性抽出物で同定された生理活性化合物の自然な比率に近い合成ブレンド（図 5D-G）は、宿主探索において有意な誘引を誘発しないようでした（χ2 = 8.15、df = 4、 p = 0.083、図 5H)、または吸血蚊 (χ2 = 4.91、df = 4、p = 0.30、図 5I)。 しかし、処理間の事後ペアワイズ比較により、ペンタン対照と比較して、24時間熟成尿の合成ブレンドに対する宿主探索蚊の有意な誘引が明らかになった（p = 0.0086、図5H）。

24 時間熟成尿の合成ブレンドにおける個々の成分の役割を評価するために、個々の化合物を除去した 6 つのサブトラクティブ ブレンドを、Y チューブ アッセイで完全ブレンドに対して評価しました。 宿主を求める蚊の場合、完全なブレンドから個々の化合物を差し引くと、行動反応に大きな影響があり (χ2 = 19.63、df = 6、p = 0.0032; 追加ファイル 1: 図 S2A)、すべての差し引きブレンドは魅力度が低くなります。フルブレンドよりも。 対照的に、完全合成ブレンドから個々の化合物を除去しても、レベルの低下をもたらしたデカナールを除いて、吸血蚊の行動反応には影響しませんでした (χ2 = 11.38、df = 6、p = 0.077)。完全ブレンドと比較した魅力の増加 (p = 0.022; 追加ファイル 1: 図 S2B)。

野外条件下で蚊を誘引する 24 時間熟成牛尿の合成ブレンドの有効性を、エチオピアのマラリア流行地域の村で 10 晩にわたって評価しました (図 6A)。 合計 4,861 匹の蚊が捕獲され特定され、そのうち 45.7% が An. gambiae sl、18.9% がハマダラカ・ファロエンシス、35.4% がアカイエカ属でした。 (追加ファイル 1: テーブル S1)。 Anopheles arabiensis は An の唯一のメンバーでした。 PCR 分析によって特定されるガンビエ種複合体。 平均すると、一晩あたり 320 匹の蚊が捕獲され、その間、合成ブレンドを餌としたトラップは、ブレンドを含まないペアのトラップよりも多くの蚊を捕らえました (χ2(0, 3196) = 170.0、p < 0.0001)。 試験の初め、中間、終わりの 5 つの対照の夜のそれぞれに、餌を与えない罠が仕掛けられました。 各ペアのトラップで同程度の数の蚊が捕獲され、家屋間に偏りがなく (χ2(0, 1665) = 9 × 10–13、p > 0.05)、調査期間中に個体数が減少しなかったことが示されました。 対照トラップと比較して、合成ブレンドを含むトラップに捕獲された蚊の数が有意に多かった: 宿主探索型 (χ2(0, 2107) = 138.7、p < 0.0001)、最近吸血した蚊 (χ2(0, 650) = 32.2) 、p < 0.0001) および妊娠中 (χ2(0, 228) = 6.27、p = 0.0123; 追加ファイル 1: 表 S1)。 これは、捕獲された蚊の総数にも反映されています：宿主を求める蚊 > 吸血蚊 > 妊娠中の蚊 > 半妊娠中の蚊 > オス。

24 時間合成牛尿臭ブレンドの有効性の現場評価。 実地試験は、メキ町（挿入）近くのエチオピア中南部（地図）で、ラテン方陣デザインを使用したペアハウス内で疾病管理センター（CDC）のライトトラップ（右）を使用して実施されました（航空地図）（A） ）。 合成臭気を餌とした CDC ライトトラップは、雌ハマダラカ (B) を差動的に誘引して捕獲しましたが、生理的状態に依存する影響であるハマダラカ (C) はそうではありませんでした。 さらに、このトラップは、宿主を求めるアカイエカ属をはるかに多く捕獲しました。 (D) 対照との比較。 左側のバーは、臭気餌付きトラップ (緑色) と対照 (開放) トラップのペアで捕獲された蚊の平均選択指数 (N = 10) を表し、右側のバーは、対照トラップ (開放、開放) のペアで捕獲された蚊の選択指数を表します。 N = 5)。 アスタリスクは統計的有意性のレベルを示します (*p = 0.01 および ***p < 0.0001)

3 種は、合成混合物を含む罠に別々に捕獲されました。 宿主探索（χ2(1, 1345) = 71.7、p < 0.0001）、吸血（χ2(1, 517) = 16.7、p < 0.0001）および妊娠（χ2(1, 180) = 6.11、p = 0.0134) アラビエンシスは合成ブレンドを放出する罠に捕らえられましたが（図6B）、Anの数には差がありませんでした。 pharoensis は、さまざまな生理学的状態で見つかりました (図 6C)。 アカイエカ属の場合、合成ブレンドを餌としたトラップでは、宿主を求める蚊の数だけが有意に多いことが判明しました（χ2(1, 1319) = 12.6、p = 0.0004、図 6D）。コントロールトラップ。

マラリア蚊が牛の尿の匂いを宿主の生息場所の合図として利用しているかどうかを評価するために、繁殖地とエチオピアの田舎の村落コミュニティとの間に潜在的な宿主から離れたところに設置された宿主おとりトラップが使用された。 宿主の合図、熱がない場合、牛の尿臭の有無にかかわらず、蚊は捕まりませんでした（追加ファイル1：図S3）。 しかし、熱と牛の尿臭の両方が存在すると、尿の年齢に関係なく、数は少ないものの、雌のマラリア蚊が引き寄せられ捕獲されました (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; 追加ファイル 1 ：図S3）。 対照的に、水対照では、熱の存在下ではマラリア蚊を捕らえませんでした（追加ファイル 1：図 S3）。

マラリア蚊は、他の昆虫と同様に、生活史形質を強化するために、牛の尿を代償的に摂食すること、つまりパドリングを通じて窒素化合物を獲得して分配します[2、4、24、25、26]。 牛の尿は、容易に入手でき、再生可能な資源であり、マラリア媒介動物の休息場所、例えば農村部の家庭や産卵場所に近い牛舎や背の高い植物と密接に関係していることがわかります。 メスの蚊は嗅覚を通じてこの資源の位置を特定し、尿の主要な窒素成分である尿素を含む尿中の窒素化合物の取り込みを調節することができます[15、16]。 メスの蚊の生理学的状態に応じて、尿中の栄養素は、宿主を求めるメスの飛翔活動と生存、および最初の性腺栄養周期中の吸血個体の​​生存と生殖特性を強化するために割り当てられます。 そのため、尿溜まりは、メスの蚊に低リスクの摂食を通じて重要な窒素化合物を獲得する能力を与えることにより、栄養不足の成虫として侵入するマラリア媒介動物にとって重要な栄養的な役割を果たしています[8]。 女性の平均余命、活動性、生殖生産量が増加し、これらすべてが媒介能力に影響を与えるため、この発見は重大な疫学的結果をもたらします。 さらに、この動作は将来のベクター管理プログラムの対象となる可能性があります。

尿の VOC プロファイルは、微生物の活動の結果として年齢とともに変化します [15、27、28、29]。 ホスト志望の女性Anさん。 アラビエンシスは、新鮮な尿と 24 時間経った尿の VOC に誘引されます (この研究、[12、13])。これは、より古い尿の VOC を好むツェツェやタバニ科を含む他の双翅目動物で見られるものとは異なります [27、30]。 、31]。 VOC の全体的な複雑さは尿が古くなるにつれて増加し、主な VOC としてはフェノールおよびフェノール誘導体が挙げられます (この研究、[27、32])。 フェノール系 VOC の混合物はツェツェやタバニッドでは誘引を引き出すのに十分ですが [30,31,32,33]、アンでは誘引に失敗します。 Mahande らによって裏付けられた arabiensis [13]およびKwekaら。 [12]。 対照的に、女性のアンを惹きつける触覚で検出される VOC のブレンド。 アラビエンシスはより複雑です。 これらのブレンドにはフェノール、p-クレゾール、m-クレゾールも含まれていますが、古い尿に比べて放出速度は低くなります。 実験室条件下で牛の尿に対する宿主を求める雌の行動反応を再現するには、これらのフェノール化合物と 3 つの追加の触覚活性 VOC の合成ブレンドが必要です。 これは、双翅目間でフェノール化合物の機能が進化的に保存されていることを示唆していますが、これらのフェノール化合物が提示される状況は、異なる種に適応的です。 野外条件下で評価すると、同じブレンドが宿主を求めるアンの魅力を引き出しました。 アラビエンシスとアカイエカ属女性ですが、アンのものではありません。 pharoensis は、保存されているが種に依存した反応を強調しています。 牛の尿 VOC は、ツェツェバエ、タバナ科ハエ、およびその他の非アブラバエに対して、宿主生息地の合図、つまり特定の地域内に潜在的な宿主の存在を示す長距離誘引物質として機能すると提案されている [34]。 しかし、蚊は牛の尿を宿主の生息地の合図として利用していないようで、このことは、蚊科（蚊）と非蚊科のハエでは異なる生態学的機能を強調している。

一方、24時間熟成させた尿の合成臭は、最近採血されて妊娠中のアンを惹きつけた。 野外のアラビエンシスでは、これは実験室条件下では観察されませんでした。 対照的に、血を与えられた雌は背景の湿った空気に強い誘引力を示し、牛の尿のVOCの影響はほとんど、またはまったくありませんでした。 実験室でのこれらの行動結果は、湿度自体が産卵前の強力な誘引物質であるという事実によって混乱する可能性があります[35]が、バイオアッセイの前提条件です。 ウシの尿は、妊娠している蚊による産卵を調節することが提案されている[14]が、この研究ではこれは支持されなかった。 牛の尿は産卵を刺激しない可能性がありますが、妊娠している蚊が産卵場所またはその隣に堆積した尿を吸収する可能性を排除することはできません。 産卵は牛の尿の影響を受けなかったため、蚊が牛の尿に引き寄せられる他のもっともらしい説明が評価されました。

新鮮な尿には主に塩分と窒素化合物が含まれており、この 2 つの栄養素は、昆虫が体力を高めるために補給食を使用して頻繁に求めるものです [2]。 ホストを求め、血を注ぐアン。 アラビエンシスは、尿の年齢に関係なく、水分摂取と同程度のレベルで牛の尿を積極的に吸収します。これは、新鮮な尿と古い尿の全体的な窒素レベルが同様であるためと考えられます。 牛の尿が老化するにつれて、微生物は尿中の窒素化合物を利用し、特に尿素をアンモニアに加水分解し、その結果微生物群集の複雑さが変化します[15]。 メスは新鮮な尿や古い尿を好む明らかな摂食傾向を示さないが、蚊は尿素に対して用量依存的な反応を示し、宿主探索蚊と吸血蚊の両方が窒素化合物の摂取量を調節していることが明らかになった。 宿主を求める蚊は、広範囲の濃度の尿素を吸収します。 しかし、これらの雌牛は、新鮮な牛や 24 時間経った牛の尿に存在するものと同様の濃度で最適な尿素摂取量を示し [15, 16]、これはスクロース対照と変わらない。 吸血された蚊は宿主を求めるメスよりも尿素と水の摂取量が少ないが、最近吸血されたメスは以前の食事によって制限されているため、これらのメスは尿素に対する反応の閾値が低い。 蚊は尿素を代謝できず、おそらく尿素をアンモニアに加水分解するためにウレアーゼを持つ腸内細菌を利用していると考えられます[36、37]。 蚊の中腸組織と脂肪体は、アンモニアをアミノ酸、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、プロリンに変換することができます [38, 39]。これらは卵黄タンパク質の重要な成分であり、プロリンの場合はアミノ酸として使用できます。飛行のためのエネルギー源 [40]。

尿素を含む尿から同化された窒素栄養素の配分パターンは独立していない。なぜなら、これらの栄養素は、宿主探索と吸血で示される生活史形質を提供するために、生理学的状態の関数として生存、飛行、生殖に配分されるからである。蚊。 これは、生活史形質が 1 つ以上の制限栄養素によって制約されるという他の昆虫で見られる栄養素配分の一般的な側面と一致しています [1、2]。 同時に複数の形質に栄養素を割り当てる必要があるため、宿主探索（逃走対生存）と吸血（生存対繁殖）蚊。 制限栄養素を含む食品の摂取量を増やす必要があると、別の配分目標に有害な栄養素の過剰摂取につながることが示されています[1、41]。 このようなトレードオフは、宿主を求める雌の蚊が、有毒な微生物叢を含む 72 時間経過した尿に引き寄せられて吸収し[15]、飛行距離は伸びるが寿命が大幅に短くなる理由を説明する可能性がある。 一方、吸血雌は 24 時間熟成した尿中の過剰な栄養素を獲得することで、これらの資源を複数の形質、すなわち生存、逃走、生殖に割り当てることが可能になります。 これは、尿による代償摂取が、1 つの淋腺栄養周期内で複数回の血液食事と同様の目的に使用できることを示しています [42]。 この配分フレームワーク [1、3] は、生活史パターンと、資源が生存、分散、繁殖にどのように配分されるかについての機構的な理解を提供します。

複数の血液食事の形での窒素化合物の代償摂食は、An. gambiae sl は、出産予備力の低い雌の卵の発育に必要であるか、または単一の性腺栄養周期で発育する卵の数と状態を高めるために必要である[43,44,45,46]。 しかし、吸血にはリスクがあり、雌にとって生殖と生存の間でトレードオフが生じるため[47]、リスクの低い別の窒素化合物の供給源、例えば牛の尿が適応的な代替手段となる。 血を与えられたメスによる代償的な尿または尿素の食事の後に産まれる卵の数とサイズの増加と同様に、生存率の増加は、複数回の血の食事の後に観察されるものを反映している[43、45、46]。 これは、An. アラビエンシスは牛の尿を利用することで、生殖形質を高めるための窒素資源の必要性と生存との間のトレードオフを最小限に抑える可能性がある。

吸血蚊は窒素化合物の大部分を代償摂食から生殖、そして部分的には生存に割り当てますが、宿主を求める蚊は主にこれらを飛行の燃料として使用します[48]。これは他の昆虫で説明されているものと同様です[49、50]。 。 尿素食後の宿主を求める雌による飛行活動の即時的かつ持続的な増加は、この資源が潜在的には前述のアンモニアからプロリンへの変換[39]と、プロリンがさらに酸化されて飛行筋肉に燃料が供給される[40、48]。 新鮮な尿を与えて宿主を求める雌によって示された夜明けの活動パターンは、アンで観察されたものを反映しています。 代償吸血を行うガンビエのメス [10]。 一方、24 時間および 168 時間熟成した尿を与えられた宿主探索メスは、光期を通じて異常な活動を示し、この期間にこれらのメスが栄養を求めている可能性があることを示唆しています。 72 時間熟成した尿を与えると、尿素を与えた後に示された活動パターンと同様の活動パターンが生じ、微生物の活動の結果として、この時点で食事中に存在する高レベルのアンモニアを反映しています [15]。 したがって、蚊は、牛の尿とその主な窒素成分である尿素を飛行のための燃料として利用する能力を持っています。

マラリア蚊は、環境に適応するために複雑な行動的および生理学的戦略を示します。 牛の尿を食べることは、状態に応じて生活史形質を強化することにより、複数の血液食事を摂取する必要性を補います。 これは、複数の血液食事の必要性を減らすことによってベクターと宿主の間の相互作用を減少させながら、毎日の生存確率とベクター密度を増加させることによって媒介能力に影響を与える可能性があります。 牛に投与された殺虫剤や抗寄生虫薬が牛の尿中に存在し、媒介動物の生活史形質獲得に悪影響を及ぼしたり、これらの治療に対する耐性の発現を促進したりするかどうかについては、さらなる調査が必要である。 尿による食事は代替の非血液窒素源を提供し、卵の発育前に代謝エネルギーを得るために事前に血液を摂取する必要がある栄養不足のメスの数を減らします。 尿を摂る傾向とその影響が、特に高齢の女性の場合、年齢によって異なる影響を受けるかどうかを評価するには、さらなる研究が必要であり、それが寄生虫を人間に感染させる可能性がある。 さらに、マラリア原虫の生存と発生に対するこの食事の影響を分析する必要があります。 将来の媒介能力のモデルでは、牛の尿やその他の窒素が豊富な資源を代償的に摂食することを考慮する必要があります。 この目的を達成するには、マラリア媒介動物における牛の尿摂食の自然な役割と、将来の媒介動物管理戦略においてこの行動がどのように操作されるかを確立するためにさらなる研究が必要である。 したがって、ここで開発された合成牛尿臭は、例えば、マラリアベクター制御のための局地的または地域レベルでの集団捕獲介入に使用される可能性がある。

この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文およびその追加ファイル内で入手できます。

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著者らはまた、野外で収集した蚊の PCR 分析を支援してくれた Elsa Quillery 博士と、HDT 実験を支援してくれた Yared Debebe に感謝します。

スウェーデン農業科学大学が提供するオープンアクセス資金。 この研究に資金を提供してくださったスウェーデン研究評議会 (VR/2014-3331) に感謝します。

アディスアベバ大学動物科学部、PO。 Box 1176、アディスアベバ、エチオピア

メンギスツ・デイビッド & ハブテ・テキエ

デブレ・バーハン大学生物学部、PO。 Box 445、デブレ・ベルハン、エチオピア

メンギスツ・ダウィット

スウェーデン農業大学、アルナルプ、スウェーデン、植物保護生物学科、化学生態学ユニット

メンギストゥ・ダウィット、シャロン・R・ヒル、ゴーラン・ビルガーソン、リッカード・イグネル

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RIとSRHがこの研究を発案した。 MDB がデータを収集しました。 MDB と SRH が統計分析を実施しました。 GB、HT、SRH、RI がこの研究を監督しました。 MDB、SRH、RI が原稿を起草しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

リッカード・イグネルへの通信。

倫理的承認は、世界医師会ヘルシンキ宣言によって定められたガイドラインに従って、アディスアベバ大学自然科学部機関研究倫理審査委員会 (CNS-IRB) (IRB/022/2016) から得られました。 医療普及員の協力を得て各世帯主の同意が得られ、地区および「ケベレ」レベルの地方行政によって承認されました。

適用できない。

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

表S1。 24時間熟成牛尿またはヘプタン対照の合成臭気混合物を餌としてCDCライトトラップで捕獲された蚊の種、性別および性腺栄養状態。 表S2。 電気生理学的分析および行動分析に使用される合成化合物。 図S1。 吸血されたハマダラカハマダラカは、新鮮な牛や熟成した牛の尿のヘッドスペースの揮発性抽出物に対して産卵を好みません。 文字の指定は、互いに有意な差がないことを示しています (Tukey の事後分析による一元配置分散分析; p > 0.05)。 エラーバーは割合の標準誤差を示します。 図S2。 24 時間熟成牛尿の完全および減算合成ブレンドに対する宿主探索型 (A) および吸血型ハマダラカ (B) の行動反応。 合成混合物 (白丸) からの単一成分の除去は、両方の生理学的状態からのメスの反応に差動的かつ顕著な影響を与えました。 異なる小文字は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの事後分析によって決定された有意差を示します (p < 0.05)。 エラーバーは割合の標準誤差を表します。 図S3。 牛の尿は、宿主の手がかりである熱の存在下でのみ、宿主のデコイトラップの捕獲を強化します。 宿主おとりトラップは、熱と牛の尿（新鮮または熟成）の両方の存在下で、繁殖地と村の間の荒れた牧草地でマラリア蚊を捕獲するだけで、どちらか単独では捕獲しませんでした。 エラーバーは平均値の標準誤差を示します。

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転載と許可

Dawit、M.、Hill、SR、Birgersson、G. 他マラリア蚊は、生活史形質を強化するために牛の尿を獲得して割り当てます。 マラー J 21、180 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12936-022-04179-6

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受信日: 2022 年 1 月 7 日

受理日: 2022 年 5 月 10 日

公開日: 2022 年 6 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-022-04179-6

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