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Nov 03, 2023

選択された非生物的要因が実際のアルテミアの孵化プロセスに及ぼす影響

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6370 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

水産養殖で広く使用されている甲殻類であるアルテミアに対する非生物的影響と生態毒性に関する現在の研究は、多くの場合、エンドポイント分析（孵化率、生存など）に焦点を当てています。 ここでは、マイクロ流体プラットフォームで長期間にわたる酸素消費量をリアルタイムで測定することによって、機構的な理解が得られることを実証します。 このプラットフォームにより、微小環境の高度な制御と形態変化の直接観察が可能になります。 デモンストレーションとして、同様に気候変動の脅威にさらされている重要な非生物的パラメータを表すために、温度と塩分が選択されています。 アルテミアの孵化プロセスは、水和、分化、羽化、孵化の 4 つの異なる段階で構成されます。 温度 (20、35、30 °C) と塩分 (0、25、50、75 ppt) が異なると、孵化段階の期間、代謝率、孵化率が大幅に変化することが示されています。 具体的には、休眠中のアルテミア嚢胞の代謝再開は、より高い温度と中程度の塩分濃度で大幅に促進されましたが、この再開に必要な時間はより高い温度にのみ依存していました。 孵化率は孵化の分化段階の期間に反比例し、温度と塩分が低いほど長く持続しました。 代謝とそれに対応する物理的変化を研究する現在のアプローチは、たとえ代謝率が低い水生種であっても、他の水生種の孵化プロセスを研究するために使用できます。

人為的活動によって引き起こされる温室効果ガス濃度の上昇は地球規模の気候に変化をもたらしており、その直接的な結果の 1 つは周囲温度の上昇です 1、2、3。 世界中の海洋はヒートシンクとして機能し、この熱の大部分を吸収します4,5。 氷河の融解と同様に、熱含有量の増加による海洋の熱膨張は、海の体積の増加を引き起こし、これは海洋水の塩分濃度に直接的な影響を及ぼします6,7。これは地球規模の水循環の変化によってさらに悪化します8,9。 。 これらのパラメーターの変動が生殖と健康に及ぼす影響は、さまざまな水生種の存在量と分布に影響を与える可能性があります。 非生物的要因 10,11 や環境毒性物質 12,13 など、さまざまな変化する環境要因が多様な種の表現型反応に及ぼす正確な作用機序が研究されています。 ここでは、リアルタイムモニタリングを通じて、一般にブラインシュリンプと呼ばれるアルテミアの孵化プロセスに対する非生物環境の変化の影響を機構的に理解することを目指しています。 アルテミアは、栄養密度が高く、養殖が容易で、サイズが比較的小さいため、水産養殖で使用される人気の生飼料です。そのため、この種は小さな口の隙間を持つ海洋幼生の給餌を容易にするのに最適です14,15。 また、生化学、生理学的、遺伝学的、生態学および生態毒性学の研究におけるモデル生物としても広く利用されています16、17、18。 アルテミアは、捕食者に対する唯一の防御機構である高塩分環境に住んでいるという事実にもかかわらず、アルテミアの孵化プロセスに対する非生物的要因の影響を機構的に理解することで、温度と塩分の変化が体に及ぼす影響についての洞察が得られる可能性がある。カイアシ類など、海洋環境に広く分布している他の甲殻類の孵化。

アルテミアの雌は、産卵モード（内因性休眠）中に代謝活性が検出できない休眠嚢胞を発症します21。 この休眠段階では、嚢胞は空気乾燥または浸透水除去によって脱水される可能性があり、その時点では嚢胞は静止状態となり、最長 28 年間生存できます 22。 環境条件が良好な場合、嚢胞の代謝は再開され、孵化が開始されます 23。孵化率に影響を与える主な非生物環境パラメータは水温と塩分です 17,24,25。 これまでの多くの研究では、アルテミアの孵化に対するこれらの非生物的環境パラメータの影響が調査されてきました 26、27、28、29、30、31 が、評価は実験のエンドポイントでの孵化率の測定に限定されていました。 たとえば、クマールら。 アルテミアの最適な孵化性能は 29 °C、塩分濃度 29 ppt で発生することを観察しました 26。 最適な条件はそれぞれ 27 ～ 28 °C と 35 ppt であることがわかりました 30。 ハサンら。 は、塩分濃度が 30 ppt、温度が 24 °C のときにアルテミアの最大割合が孵化し、塩分濃度が 20 ～ 40 ppt の範囲にある間、温度が 24 °C から 32 °C に上昇するにつれて孵化率が減少することを示しました 27。 アーメドら。 は、孵化率に最適な塩分濃度は 20 ppt であると報告しました31。 Bahrらによって行われた別の研究では、 孵化に対する塩分濃度の影響については、最適な孵化率は塩分濃度 60 ppt、温度約 30 °C であることがわかりました 28。 最適なパラメーターの変動は、テスト設定の違い (たとえば、露光 25、30、32) または環境条件の変動 (容器のサイズ、バルク媒体の温度/塩分濃度勾配) に起因する可能性があります。

この研究は、環境条件を統一し、非生物パラメータの影響の理解を孵化率というエンドポイント指標を超えて、アルテミアの孵化プロセスに及ぼす影響の詳細な機構分析にまで拡張することを目的としています。 アルテミアの孵化の 4 つの異なる段階、(1) 水和、(2) 分化、(3) 羽化、および (4) 孵化 33 は、形態学的変化と代謝に基づいて区別できます 34,35。 この研究では、光学式酸素センサーをマイクロ流体「水族館」に組み込み、孵化プロセス全体を通じて日常代謝率とも呼ばれる酸素消費率 36 をリアルタイムで監視するとともに、光学顕微鏡を使用して観察を行いました。一定の時間間隔で孵化した嚢胞の顕微鏡写真。 これまでに、アルテミア嚢胞 37 や、Acartia Tonsa 38,39、Leptodora kindti 40 などの他の小型甲殻類の代謝が、さまざまな呼吸測定技術を使用して研究されてきました。 この研究で使用されたマイクロ流体プラットフォームのサイズが比較的小さいため、酸素センサーの信号対雑音比 41,42,43 が減少し、センサーデータと顕微鏡画像データの相関関係が可能になります。 また、このプラットフォームは、現代の研究で使用されているバルクシステム（ビーカー、水槽など）と比較して、オフチッププログラマブルコントローラーを使用して均一な環境条件をより容易に維持できます44、45、46。 最近、マイクロ流体およびミリ流体のラボオンチッププラットフォームは、細胞での薬物検査47、C.エレガンス48、49、50、51、52、ゼブラフィッシュ53、54、55などの種の生物学的研究を含む製薬用途に使用されています。 さらに、今回の研究では、試験サンプル全体をふるい付き計数チップに自動移送することで、汚染と人為的エラーを最小限に抑えながら、孵化率のエンドポイント分析の精度も向上しています。バッチサンプルや手動の計数方法に依存するのではなく、全体を画像化して画像解析で処理できる構造のようなものです。

アルテミア シストはブライン シュリンプ ダイレクトから購入し、孵化研究の 1 日前までベンダーの推奨に従って 4 °C で保存し、その時点で段階的な温度順応を可能にするために室温に移しました。 図 1A は、受け取ったままのアルテミア嚢胞の走査型電子顕微鏡 (SEM) (JEOL FS-100) 画像を示しています。 嚢胞はカップ状の構造をしており、カップの円形構造の直径は 180 ～ 260 μm の範囲にあります。

実験的なセットアップ。 (A) 走査型電子顕微鏡 (SEM) は、受け取ったままのアルテミア嚢胞のカップ状構造を 450 倍の倍率で示します。 (B) アルテミアの孵化性能に対する非生物環境パラメーターの影響を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの概略図。 (C) 一体型 O2 センサーと温度プローブが接続されたハッチング チップ (スケール バー = 5 mm) (O2 センサー スポットの位置は挿入図に示されています) (D) 出口に PDMS マイクロピラーで作られたふるいのような構造を持つ計数チップ (スケール バー = 5 mm)バー = 10 mm) [ふるい構造に捕捉された嚢胞とノープリウスが挿入図に示されています (スケール バー = 500 μm)]。

アルテミア嚢胞の孵化研究は、マイクロ流体プラットフォーム上で実行されました (図 1B)。 プラットフォームは、入口と出口（高さ1.7 mm、幅4 mm）に接続された円筒形のチャンバー（直径13 mm、高さ3.55 mm）を持つハッチングチップで構成されていました（補足図1A）。 孵化チップの総量は約 563 μL です。 孵化開始時の挿入時と実験終了時の嚢胞およびノー​​プリウスの移送時に嚢胞がチャンバーの隅に捕捉されないように、入口と出口に丸い角（フィレット）が組み込まれています。 ANSYS FLUENT で流体の流れをシミュレートすることで、デッドボリュームが最小限に抑えられました (補足図 1B)。 図 1C は、この研究に使用された孵化チャンバーを示しています。 チップはポリジメチルシロキサン（PDMS）で構成され、3Dプリンター（MAX X-43、Asiga）を使用して準備された型（補足図1C）にPDMSをキャストすることによって製造され、重力対流オーブン（モデル）で60°Cで一晩硬化されました。 ：10GC、クインシー研究所）。 ハッチングチップは2層になっています。 上層にはチャンバーとチャネル構造があり、下層はブランクの PDMS スラブです。 ハッチング チップの上層と下層の両方を、コロナ処理 (BD-20AC、ETP) を使用して接着し、続いて 60 °C で一晩加熱しました。 層を接着する前に、入口、出口、センサー用の生検パンチを使用して最上層にいくつかの穴を開けました。 O2 センサー スポット (OXSP5、Pyroscience) を、シリコーン接着剤 (Spglue、Pyroscience) を使用してチャンバー内の PDMS 最上層に接着しました。 光ファイバーは、PDMS チップの穴を通して O2 センサー スポットのちょうど後ろに接続されました。 光ファイバーを外部の光学式酸素計 (FireSting®-O2、Pyroscience) に接続しました。 酸素計は、発光ダイオード (LED) とフォトダイオードで構成されており、酸素に敏感なスポットの酸素依存発光発光を刺激および検出し、孵化中のチャンバー内の水の溶存酸素濃度を毎秒測定します。 温度プローブ (Pt100、Pyroscience) もチップに接続され、チップ内の水の温度を検出し、温度変動に対する溶存酸素濃度の読み取り値を補正しました。 変動を最小限に抑えるために、チップを、比例積分微分 (PID) コントローラー (6 ～ 30 V DC 電子サーモスタット コントローラー、DROK) に接続されたフィルム ヒーター (PI フィルム ヒーター - 24 V、Icstation) の上に置き、設定温度（20、25、30 °C）に応じた孵化チップ内の水の温度。 可変電圧 DC 電源アダプター (ALP002、KEJIESHENG) を PID コントローラーへの電力供給に使用し、熱電対プローブ (TC 10K、青島) を接続してチップ内の水温を測定しました。 PID コントローラーは、プローブ測定に従って入力電力を調整し、設定温度からの最大変動を 0.1 °C に維持します。 ヒーターが埋め込まれた孵化チップを、デジタル カメラ (MD500、Amscope) を備えたデジタル実体光学顕微鏡 (SE400-Z、Amscope) の下に置き、孵化中 5 分ごとにチップの顕微鏡写真を撮影しました。 孵化プロセス全体の間、発光ダイオード (LED) ライト (1W、Amscope) は孵化に影響を与えるため、継続的に点灯され続けました 26,32。

実験の開始前に、孵化用の水は、脱イオン水 (DIW) にさまざまな量の市販の海塩 (Fluval Sea、pH: 8.1 ～ 8.2) を加えて調製しました (調製および濾過 (フィルター孔径 = 200 nm))。 ) Barnstead Smart2Pure 浄水システム、Thermo Scientific) を使用して、塩分濃度 0、25、50、および 75 ppt の人工塩水を生成し、ボルテックス ミキサー (Vortex genie 2、Scientific Industries) を使用して試験管内で混合しました。 。 塩水溶液を十分に混合すると、溶存酸素と塩分が均一に分散されます。 アルテミアシストの重量をデジタル精密天秤（Bonvoisin）を使用して測定し、シスト濃度が5 g/Lになるように塩水溶液と注意深く混合した。 嚢胞溶液は、チャンバーが満たされるまで孵化チップの内側に直ちに挿入されました。 次に、チップ内部への空気の侵入を防ぐために、チップの入口と出口をフレキシブルチューブとバインダークリップを使用して閉じました。 孵化実験は、嚢胞を生理食塩水に浸漬してから 24 時間実施しました。 孵化実験は、各温度 (20、25、および 30 °C) および塩分濃度 (0、25、50、および 75 ppt) の条件で 3 回実行されました。

アルテミアのさまざまな孵化段階とそれらの間の移行は、嚢胞による酸素消費の結果として生じる、密閉孵化チップ内の水の溶存酸素濃度の減少 (DDOC) の変化によって識別できます。チップ酸素センサーと光学顕微鏡で撮影した顕微鏡写真。 これにより、孵化のさまざまな段階の酸素消費量と期間に関する情報が得られます。 孵化のさまざまな段階の絶対値と期間は温度と塩分によって変化するため、酸素消費量の結果は各段階の酸素濃度率 (ROC) を考慮して正規化されます。 ROC は、文献に記載されているように、標準代謝率とみなすこともできます 36。 ROCは次の式を使用して計算されました。

各孵化段階で、出現期間と孵化段階が 24 時間の孵化期間内に完了しなかった特定の温度と塩分を除き、期間と対応する ROC が測定されました（「水の塩分濃度と温度が孵化に与える影響」を参照）孵化のさまざまな段階の期間」）。

孵化チップの深さ (3.55 mm) は、懸濁液が孵化に十分な溶存酸素とノープリウスが泳ぐためのスペースを確保できるように設計されました。 この深さにより、同じ垂直面に複数のノープリウスと嚢胞が存在することが可能になり、ノープリウスと嚢胞の正確な計数が不可能になりました。 したがって、ノープリウスと嚢胞が単一の単層に制限されるように、浅い深さ（800 μm）のチャンバーを備えた計数チップ（図1D）が設計されました。 チップには入口と出口がありました。 出口にはふるいのような構造として機能するPDMSマイクロピラーが含まれており（図1D挿入図）、水のみがチャネルを通過できるようにして、チャンバー内のノープリウスと嚢胞が逃げるのを防ぎます。 チップには 2 つの層がありました。最上層にはチャンバー、マイクロピラー構造、入口、出口があり、3D プリントされたモールド上にキャストされた PDMS で構築されました (補足図 2A)。 最下層はブランクのPDMSスラブでした。 両方の層は、上記のようにコロナ処理とその後の加熱を使用して結合されました。 計数チップの入口と出口では、高さがチャンバーの高さより高く (1.7 mm 対 800 μm)、入口と出口を通るアルテミア嚢胞とノープリウスのスムーズな流れを可能にするためにフィレット半径 900 μm で設計されています。 。 補足の図2Bは、チップを通る流体の流れのANSYS Fluentシミュレーションの結果を示しており、デッドボリュームがないことを示しています。 24時間後、孵化チップ内の孵化ノープリウスおよび孵化/未孵化嚢胞を、シリンジポンプ(Pico plus 11 Elite、Harvard Apparatus)により、30%メタノール溶液中、100μL/分の流速で計数チップに自動的に移した。 ハッチングチップの出口と計数チップの入口はポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブで接続され、ハッチングチップの入口はフレキシブルなタイゴンチューブを介してシリンジポンプに取り付けられたシリンジに接続されました。 アルテミア ノープリウスは孵化後に急速に泳ぎ、DIW 中の 30% メタノール溶液を使用してノープリウスを安楽死させ、計数チップで鮮明な画像を取得しました。 デジタル カメラ (D3100、Nikon) を使用して、ノープリウスと孵化チップ内に存在する嚢胞の画像を撮影しました。 画像はImageJで処理され、嚢胞とノープリウスの数がそれらの円形度に基づいて数えられました。 円形度が 0.9 以上の物体がある場合、それは嚢胞 (ハッチングまたはハッチングなし) であると考えられ、画像内の円形度が低い (0.9 未満) ものはノープリウス座であると考えられました (補足図 1)。 3)。 孵化率は以下の式で計算しました。

すべての統計分析には、OriginPro (ver. 2022b、OriginLab) を使用しました。 データは平均±標準偏差として表されます。 「酸素消費率とさまざまな段階の期間」で前述したように、特定の温度と塩分では、羽化段階と孵化段階は 24 時間以内に完了しませんでした。 したがって、これらの段階では、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続くボンフェローニ事後検定を使用してデータの重要性が決定されました。 ただし、最初の 2 つの段階 (水和と分化) と終点の孵化率については、すべての温度と塩分でデータが取得され、グループ内およびグループ間のデータの有意性は、ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析を使用して決定されました。 。 ANOVA 表は補足表 1 に含まれています。ANOVA 検定を実行する前に、信頼水準 95% の正規分位数-分位数プロットを使用してデータの正規性が検査されました。 異なる結果間の相関関係の分析は、ピアソン相関係数を使用して実行されました。 p < 0.05 の場合、データはすべての統計分析で有意であると見なされます。

アルテミア嚢胞が孵化すると、酸素消費量と形態が変化します。 方法のセクションで説明したように、これらの変化は、オンチップ酸素センサーと光学顕微鏡を使用して記録されました。 図 2A は、孵化のさまざまな段階の顕微鏡写真を示しています。 図 2B は、孵化チップ内の水の溶存酸素濃度 (DDOC) の減少を示しています。 孵化チップ内にシストがある場合、孵化プロセス中にシストが酸素を消費するため、水中の溶存酸素濃度が減少し、DDOC が増加します (青色の実線)。 各段階での酸素消費率 (ROC) は式 1 で推定されます。 (1) は、図 2B (緑色の実線) にも示されています。 孵化チップに人工塩水のみが含まれシストが含まれていない場合 (対照実験)、DDOC (青い点線) と ROC (緑の点線) はほとんど無視できました。 孵化チップ材料の PDMS は酸素透過性であるにもかかわらず 60,61、チップ内にシストのある DDOC とシストのない DDOC (コントロール) を比較すると、すべての段階での酸素消費速度が酸素透過率よりも大幅に大きいことに注意することが重要です。これにより、異なる環境条件下で DDOC を定性的に比較するための現在のセットアップの使用がサポートされます。 この研究で孵化に使用されたアルテミア嚢胞は滅菌されていないため、溶存酸素の一部を消費する微生物が含まれている可能性があることに注意してください。 この研究では、DDOC に対する嚢胞の影響と微生物の潜在的な存在は区別されておらず、さらなる調査が必要です。 しかし、対照実験（図2Bの点線）では、24時間の期間にわたってDDOCのごくわずかな変化が示されているため、孵化チップも人工塩水自体の潜在的な微生物もDDOCの変化に寄与していないと結論付けることができます。 。

孵化のさまざまな段階での顕微鏡写真と O2 センサーの測定値。 (A) 光学実体顕微鏡から得られた孵化のさまざまな段階での顕微鏡写真 (スケール バー = 500 μm)。 挿入図は、さまざまな段階での嚢胞/ノープリウスの形態を示しています (スケール バー = 100 μm)。 (B) 25 °C、25 ppt でのハッチング チップにアルテミア シストがある場合 (青色の実線) とシストがない場合 (コントロールの青色の破線) の溶存酸素濃度 (DDOC) の減少のオンチップ検出。 さまざまな段階での酸素消費率（ROC）は緑色の線で表されました（実線 - 嚢胞、点線 - 対照）。 グラフ内の太線は平均を示し、影付きの領域は標準偏差を示します。 (B) の赤い三角形は、(A) に示した顕微鏡写真に対応する時点での DDOC を表します。

嚢胞を水に浸漬すると水和段階が始まり、嚢胞が膨張して（カップ状ではなく）球状に成長します [図1]。 2A(i)]。 嚢胞が水を吸収すると、エネルギー代謝、RNA、タンパク質の合成が短期間のうちに始まります 34,62。 エネルギー代謝が再活性化されると、ROC の増加によって証明されるように、呼吸活動が劇的に増加します (図 2B)。 水和段階の終わりには、嚢胞の大部分が球形になり、分化が始まります。 また、この段階では細胞分裂も DNA の増加もありません 34,62 ため、酸素要求量はほぼ一定で低くなり、ROC が低下します (図 2B)。 第 3 段階（出現）では、グリセロール量の増加による内部の膨圧の増加により嚢胞の殻が破壊され始め、孵化膜内の壊れた殻から胚が出現し始めます。 2A(iii)]35． 羽化段階は非常に活性が高く、追加のエネルギーを必要とするため、DDOC と ROC が増加します (図 2B)。 最後に、最終段階（孵化）では、アルテミアの胚は嚢胞殻と孵化膜を離れて泳ぎ始めます（図1）。 2A(iv)]。 この段階では、ROC の相対的な減少によって検出されるように、酸素要求量は再び低下しました (図 2B)。

さまざまな温度と塩分における孵化の各段階の期間を図 3 に示します。全体として、テスト範囲の最低温度 (20 °C) および/または最低塩分 (0 ppt) では、24- 25 ppt で 20 °C、30 °C で 0 ppt を除いて、最初の 3 つの各段階の時間が長かったため、h 時間では孵化を完了するには不十分でした。 これと一致して、塩分濃度が 25 および 30 °C で 75 ppt に増加すると、孵化段階の期間 (羽化段階の終わりに残っている時間として定義される) が大幅に減少することがわかりました。 20 °C (塩分濃度が 25 ppt のみで孵化段階が観察された場合) では、塩分に関係なく、調査した他のすべての温度と比較して孵化段階の期間が大幅に短縮されました。

さまざまな水の塩分濃度と温度での孵化のさまざまな段階の期間。 値は平均値 ± 標準偏差 (n = 3) として表されます。 各カテゴリ (水和および分化段階の期間) で、同じ文字を共有しない平均値は互いに大きく異なります (ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析、p < 0.05)。 24 時間以内に完了しなかった孵化段階は統計的に分析されず、「nc」とマークされました。 * と # は、他の試験温度と比較して、ある温度での羽化期と孵化期の期間がそれぞれ大きく異なることを示します (ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析、p < 0.05)。 ** は、試験した 2 つの異なる塩分の間で孵化段階の期間が大きく異なることを示します (ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析、p < 0.05)。

水分補給中（緑色のバー、図 3）、乾燥したアルテミア嚢胞が浸透圧によって水を吸収することを認識すると 63、温度と塩分の影響はヴァント ホフの法則 64 によってモデル化できます。

ここで、Δπ は浸透圧の差、R は普遍気体定数、T は温度、ΔC は溶質濃度の差です。 温度（T）が増加すると、図3に示すように水和期間の減少に対応して浸透率も増加します。補足の図4Aは、ピアソン相関によって決定される水和期間と温度の間の有意な負の相関を示しています。係数（r = − 0.9）とこれらのパラメータ間の線形フィット（R2 = 0.99）（補足図4B）。 同時に、どの温度でも水の塩分濃度が上昇すると、嚢胞の内部と外部の溶質濃度の差 (ΔC) が減少する可能性があり、水和期間の増加に伴って浸透圧が低下するはずです。 しかし、実験結果は、塩分の変化が水和持続時間に大きな影響を及ぼさないことを示しています。 対照的に、30 °C を除くどの温度でも、温度が上昇するか、塩分濃度が 0 ～ 25 ppt に上昇すると（25 ppt を超えて大きく変化しない）、分化期間（図 3 の青いバー）は大幅に減少しました。 これを理解するために、分化段階を経て嚢胞が出現段階に達し、トレハロースからのグリセロールの合成によって引き起こされる膨圧の上昇によって殻が破壊され始めることに注目します。 温度の上昇によりグリセロール合成が促進され63、分化期間が短縮されます。 塩分が増加するとグリセロールレベルも増加し 35、分化期間が短縮される可能性があります。 しかし、水の塩分濃度が上昇すると、外部環境は高張になり、外浸透プロセスにより細胞の水分が失われる可能性があり、より高い塩分濃度では分化期間が長くなる可能性があります。 これら 2 つの相反する要素間の競合により、塩分濃度が 25 ppt を超えると分化段階の期間に有意な差が見られなかった理由が説明される可能性があります。 興味深いことに、羽化段階の期間（図 3、オレンジ色のバー）は、最適温度が 25 °C であることを示唆しており、20 および 30 °C と比較して期間は大幅に短縮されています。 温度は浸透圧を上昇させるのに役立ち、したがって水和および分化段階の長さを短縮しますが、一旦羽化段階が始まり、胚が孵化膜内で羽化すると、高温に対する耐性が低下するようです。 したがって、中間温度 25 °C は羽化段階に適しており、完了までの時間が短くなります。

孵化プロセスをさらに理解するには、温度と塩分を変化させた孵化室内の水の溶存酸素濃度 (DDOC) の減少を直接調べることができます。 補足図5は、各温度および塩分条件で実行された3回の実験の平均DDOC曲線を示しています。 全体として、結果は、塩分濃度がゼロより大きい場合の孵化期間と DDOC の間に正の相関があることを示しています。

24 時間の孵化期間の総 DDOC、または総酸素消費量を図 4A に示します。これは、塩分に関係なく、この温度では総酸素消費量が高くなるため、最適温度 (25 °C) の存在を示しています。 塩分濃度に関係なく、温度が 20 °C から 30 °C に上昇すると、総酸素消費量は大幅に減少しました。 塩分濃度は、温度に関係なく、25 ppt から 75 ppt に増加した場合にのみ、総酸素消費量を大幅に低下させました。 ただし、塩分濃度を 30 °C で変更しても大きな変化はなく、温度と塩分の間に重大な相互作用があることが示唆されました。 使用した乾燥初期嚢胞の重量に基づくと、この総酸素消費量は、温度と塩分を変化させた場合、5.81 × 10-7 ～ 3.47 × 10-5 mg O2/h/mg 乾燥重量の範囲であり、酸素消費量と同等です。 Artemia37、および初期の研究で報告されている Anomalocera patersoni65 や Pontella mediterranea66 などの他の甲殻類の卵の卵。

さまざまな温度と塩分下でのアルテミア嚢胞の酸素消費量。 (A) 異なる温度と塩分下での孵化プロセス全体にわたる総酸素消費量、または総 DDOC。 (B) 孵化のさまざまな段階での酸素消費率 (ROC): (i) 水和、(ii) 分化、(iii) 羽化、および (iv) 孵化段階。 値は平均値 ± 標準偏差 (n = 3) として表されます。 データの各カテゴリ (総酸素消費量、または水和および分化段階での ROC) において、列の上の文字を共有しない平均値は互いに実質的に異なります (ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析、p < 0.05) 。 異なるテスト温度では、統計的に有意な ROC はそれぞれ * (ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析、p < 0.05) および ** (ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析、p < 0.05) で示されました。 # は統計的に有意な総酸素消費量を示します (ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析、p < 0.05)。

孵化の 4 つの段階のそれぞれでの酸素消費量を考慮することで、孵化プロセスに対する温度と塩分濃度の影響をより詳細に理解できます。 塩分濃度に関係なく、温度が 20 °C から上昇すると、水和中に ROC が大幅に増加しました [図 4]。 4B(i)]。 ROC もまた、25 ～ 75 ppt の間で塩分濃度が増加すると大幅に減少しました。これは、より長い期間に応じた活性の低下を反映しています (図 3)。 一方、塩分と温度の両方が分化期間を短縮しましたが、代謝率には大きな影響はありませんでした[図1]。 4B(ii)]。 羽化段階では、ROC は温度に大きく影響されるが、p = 0.05 レベル (一元配置分散分析) では塩分には影響されないことが判明し、温度が 25 °C から 30 °C に上昇すると ROC は大幅に減少しました (Bonferroni、p < ０．０５、図４Ｂ（ｉｉｉ））。 一部の実験条件では出現が不完全であるため、データの統計的有意性はボンフェローニ事後検定を備えた一元配置分散分析を使用して評価されたことに注意してください（図3）。 体温の上昇に伴う酸素消費量の減少は、生理学的ストレスを示している可能性があります。 最後に、孵化期では羽化期に比べて ROC が減少し、塩分濃度に関係なく 25 °C で最大となり、この段階では塩分濃度は ROC に影響を与えない。 羽化時のエネルギー需要の同様の増加と孵化後のエネルギー需要の減少は、Acartia Tonsa67、Cheraxquadricarinatus68、Cancer pagurus69などの他の甲殻類種でも観察されました。 我々の研究では、羽化期のアルテミア嚢胞の乾燥重量単位当たりの酸素消費量は、温度と塩分が変化し、7.98 × 10-7 ～ 2.5 × 10-5 mg O2/h/mg 乾燥重量の範囲でした。 上限に基づくと、アルテミア嚢胞の出現時の酸素摂取量は、大型の甲殻類Cancer pagurus69より約5.54倍低く、小型の甲殻類Pontella mediterranea66より0.43倍高い。 さらに、特定の温度および塩分条件下では、孵化段階で負のROCが観察されました。 20 °C および 30 °C で 25 ppt の塩分濃度では、これは孵化したアルテミアの酸素消費量が非常に低いことと、PDMS を介した非常に少量の酸素の透過の可能性によるものである可能性があります (図 2B の対照実験を参照)。 しかし、0 ppt/30 °C では、潜在的に塩分ゼロと高温の複合効果により、すべてのノープリウスが孵化後に死亡した (移動性がない) ことが観察され、理由は不明ですが、孵化中に水の酸素濃度が増加しました。この時。 考えられる説明の 1 つは、孵化プロセス中に一部の嚢胞が気泡を放出するのが観察され、その気泡が最初は嚢胞の殻内に閉じ込められていた可能性があるということです。 生きているノープリウスは、この余分な酸素を気泡から消費します。 しかし、この例では、生きたノープリウスが存在しなかったため、孵化水の酸素含有量はわずかに増加しました。 ただし、この酸素含有量の増加の正確な理由は不明であり、さらなる調査が必要です。

図 5 は、さまざまな温度と塩分における、当社のプラットフォームにおけるアルテミア シストの孵化率 (式 (2) を使用して推定) を示しています。 以前の研究によれば、結果は最適条件の存在を示しています27,30。 具体的には、温度が20℃から25℃に上昇すると孵化率は劇的に増加しましたが、それ以上温度が上昇しても大きな変化はありませんでした。 同様に、塩分濃度が 20 および 25 °C で 0 ～ 25 ppt、30 °C で 0 ～ 50 ppt に増加すると、孵化率は増加しましたが、その後、塩分濃度が増加すると減少しました。 最大孵化率は、測定された最大 ROC に従って、温度 25 °C、水塩分 25 ppt (76.85 ± 14.22%) で観察されました。 4(iv)]。 さらに、測定された ROC は、塩分ゼロおよび 20 °C での孵化率が非常に低いことは、（活動が観察されているため）必ずしも過酷な条件を反映しているわけではなく、24 時間の持続期間では不十分であることを示しました。

さまざまな水の塩分濃度と温度におけるアルテミアのオンチップ孵化率計算。 値は平均値 ± 標準偏差 (n = 3) として表されます。 列の上に同じ文字を共有しない平均値は、互いに実質的に異なります (ボンフェローニによる二元配置分散分析、p < 0.05)。

孵化プロセス全体がリアルタイムで監視されるこのアプローチは、非生物的パラメーター、ステージ特性 (期間、ROC)、および孵化率の間の関係の理解を独自に前進させます。 これらのパラメータを定量化するために、ピアソン相関を実装しました。 まず、ROC は温度、塩分、またはその両方によって大きく影響されましたが、孵化段階の ROC のみが孵化率と統計的に有意な関連 (正の相関) を示したことに注目します。 一方、分化期間のみが孵化率と有意な相関を示します（負の相関）。

孵化率と水和、分化段階期間との間の負の相関、および孵化率と孵化段階期間との間の正の相関が観察された。 孵化率は、温度が 25 °C、塩分濃度が 25 ppt のときに最大でした。 試験条件の中で温度や塩分濃度が低いまたは高い場合、水和と分化の段階に時間がかかり、孵化の段階は短くなりました。 同様に、酸素消費量は、水和および孵化段階では孵化率と正の相関関係がありますが、分化段階では孵化率と負の相関関係があります。 温度 25 °C、塩分 25 ppt では、酸素消費量は水和段階では比較的高く、分化段階では低く、孵化段階では非常に高くなりました。 このパターンは、テストされた温度または塩分が非常に低いまたは非常に高い場合には逆転しました。 これらの発見は、温度と塩分が孵化プロセス全体に大きな影響を与えることを示しています。 最高の孵化率は、嚢胞の大部分が水和し、水和段階でより短期間でより高い代謝率を回復し、分化段階でのエネルギー消費が少なくなり、分化段階がより迅速に完了する、好ましい温度と塩分条件で得られます。 この最適な条件では、嚢胞は孵化段階でより長い時間を費やし、その結果、より多くの嚢胞が孵化し、酸素消費量が増加します。

この研究では、リアルタイムでの代謝率とそれに対応する形態学的変化の測定により、非生物的パラメータがアルテミアの孵化プロセスにどのような影響を与えるかについての深い機構的理解が得られる可能性があることを実証しました。 温度と塩分（気候変動の影響を受けやすい2つの重要な環境パラメータ）に焦点を当て、所定の期間を通じて、異なる温度と塩分レベルの下で、呼吸行動、孵化の進行、およびその結果として孵化したアルテミアの数を測定しました。 アルテミアの生息地は高塩分濃度によって制限されているが、この研究は、より広く分布している他の甲殻類種の孵化過程に対する温度と塩分濃度の考えられる影響を明らかにすることができる。

以前の研究によれば、極端な塩分濃度（低または高）と低温がアルテミアの孵化を阻害することが観察され、最適な孵化条件の存在が確認されています26、27、28、29、30、31。 ただし、これらの以前の研究は主に孵化率のエンドポイント測定に焦点を当てていますが、ここでは孵化率と孵化の進行およびプロセス全体の呼吸行動の間の関係を確立しました。 例えば、我々は、24 時間の期間におけるアルテミアの孵化率に影響を与える重要な要因は分化段階の期間であることを実証し、これは孵化率に反比例することがわかっています。 全体として、非常に高い塩分濃度の場合を除き、塩分濃度と温度の両方が増加すると、分化の持続時間 (図 3 の青いバー) が減少します。 分化段階の理解に基づくと、この関係は、羽化の開始を特徴づける殻の破壊を促進するグリセロール生成の増加に関連している可能性があります。 この仮説の検証は将来の研究に委ねられますが、現在の実験が環境と水生動物の健康の間の複雑な関係を理解するために焦点を当てている重要な領域に焦点を当てていることを示します。 温度、塩分、および休眠嚢胞代謝の再活性化との間の重要な関連性も、水分補給の進行をヴァント・ホフの法則と比較することによって明確に証明された。

この実験的アプローチは、光学顕微鏡を使用してアルテミア嚢胞の物理的変化も記録できる、酸素センサーが組み込まれた新しいマイクロ流体プラットフォームの開発によって可能になりました。 正確な環境制御は、フィードバック ループを備えたヒーターを使用して実現され、自動計数チップは、厳格な環境制御の欠如や孵化率の手動計算に伴うエラーを排除するように設計されています。 生物学的プロセスをより詳細に観察できるようにするだけでなく、正確な環境制御を備えた自動システムの普及により実験が標準化され、文献内でより有益な相互比較が可能になります。 したがって、本アプローチは、さまざまな非生物的/生物的環境条件および水生汚染物質下を含む、動物プランクトンおよび魚類の幼生の研究においてより広範な適用可能性を有することが期待される。

データセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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この研究は、国立科学財団によって支援されています (賞番号: 2038484、年: 2020)。 グラフは、OriginPro 2022b (https://www.originlab.com/) を使用してプロットされました。 回路図は Biorender (https://biorender.com/) を使用して作成されました。

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テレンス・M・ブラッドリー

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PD: 概念化、方法論、調査、形式的分析、視覚化、執筆 - 原案。 TB: 概念化、監督、正式な分析、執筆、レビューと編集、資金調達。 AB: 概念化、監督、正式な分析、執筆、レビューと編集、資金調達。

アリシア・ボイメルグリーンへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Dey, P.、Bradley, TM & Boymelgreen, A. マイクロ流体プラットフォームにおける酸素変化のリアルタイム観察による、アルテミアの孵化プロセスに対する選択された非生物的要因の影響。 Sci Rep 13、6370 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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