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Nov 13, 2023

高酸素微小環境を介して腫瘍の進行を遅らせるためのマイクロ酸素工場の設計

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 4495 (2022) この記事を引用

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10 件の引用

12 オルトメトリック

メトリクスの詳細

低酸素は発がん、腫瘍の攻撃性、転移、腫瘍治療への抵抗性を促進しますが、生体内で長期にわたる酸素供給を提供することが大きな課題であるため、腫瘍に対する高酸素の影響はほとんど調査されていません。 本研究では、獲得したシアノバクテリアとアップコンバージョンナノ粒子をアルギン酸マイクロカプセルに封入することにより、マイクロ酸素工場、すなわち光合成マイクロカプセル（PMC）を構築します。 このシステムは、外部放射線をシアノバクテリアの光合成用の赤色波長発光に変換することにより、長期にわたる酸素供給を可能にします。 PMC 治療は、NF-κB 経路、HIF-1α 産生、および癌細胞の増殖を抑制します。 in vivo PMC インプラントによって生み出される高酸素微小環境は、肝がんの増殖と転移を阻害し、乳がんにおける抗 PD-1 阻害剤と相乗効果をもたらします。 エンジニアリング酸素工場は、高酸素微小環境における腫瘍生物学研究の可能性を提供し、腫瘍学的治療の探求を刺激します。

低酸素症は固形腫瘍の微小環境の最も広範な特徴であり 1,2 、酸素供給の不足と、急速に増殖するがん細胞による酸素消費の増加との間の不均衡から生じます。 その結果、がん細胞は低酸素環境で生存するために複数の適応経路とゲノム変化を利用します3。 低酸素応答のメディエーターとして最もよく知られている転写因子低酸素誘導因子 1α (HIF-1α) は、腫瘍の血管新生を刺激して酸素と栄養素の供給を強化する上で中心的な役割を果たしています4。 逆説的ですが、これらの血管は不規則に組織化されていることが多く（ねじれ、高透過性、盲端構造など）、酸素の拡散または灌流に欠陥があり 5、腫瘍内の低酸素領域の拡大を引き起こします。 同時に、悪性腫瘍の特徴である低酸素微環境は、免疫抑制環境を作り出し6、DNA修復経路を活性化し7、オートファジーフラックス8を可能にすることにより、腫瘍をさまざまな治療法から守る主要な障壁であるだけでなく、発がんの促進剤でもある9ことが報告されています。 、腫瘍の浸潤性と転移1、2。 これらの発見は、腫瘍生物学や治療研究のために低酸素微環境を高酸素微環境に変換する技術の探求にインスピレーションを与えました。

生体適合性のある一定の酸素源が不足しているため、腫瘍内に長期にわたる高酸素微環境を構築することは大きな課題です。 藻類の微生物が地球上の O2 の主要な供給者であることを考慮すると、藻類の葉緑体における光合成は、腫瘍における O2 補給のために研究される可能性があります。 光合成機構には、650 ～ 700 nm の光子を放出する適合した光源が必要です。 希土類ベースのアップコンバージョンナノ粒子（UCNP）は、生体透明な近赤外（NIR）レーザーを可視光に変換する並外れた能力を示しているため、これらの材料を利用して、光合成で利用可能な光子を提供することができる可能性がある。 したがって、我々は、藻類微生物とUCNPの合理的な構築によって、長期にわたる高酸素微環境を作り出すことができるという仮説を立てました。

本研究では、静電液滴技術により作製可能なアルギン酸マイクロカプセル（MC）にシアノバクテリアとUCNPを封入し、光合成マイクロカプセル（PMC）を開発しました。 生理学的条件に適応するのに適した株を取得するために、4 つのシアノバクテリア株を順化選択に供しました。 私たちは、NIR 放射線、細胞数、UCNP 線量が O2 生成に及ぼす影響を包括的に調査し、最適化された PMC 配合を設計します。 PMC によって作られる高酸素微小環境の影響を、マウスの同所性乳がんとウサギの移植肝がんを含む 9 つのがん細胞株と 2 つの腫瘍モデルで調べます。

我々の仮説を実証するために、我々はまず、生理的条件に順応した藻類微生物の選択、光合成と互換性のあるUCNPの合成、MCへの藻類微生物とUCNPのカプセル化など、提案されたPMCシステムの設計を試みました。 4 つの親藻微生物、すなわち球状の Synechocystis sp. この研究では、Chlorella ellipsoidea (C. ellipsoidea)、棒状のSynechococcus elongates 7942 (S. elongate. 7942)、および船型のScenedesmus obliquus (S. obliquus)が選択されました。 (補足図1)。 25℃のBG11培地で生育したこれらの藻類微生物は、37℃の哺乳動物細胞培養培地（DMEMなど）では生存できないため、温度を段階的に変更することにより生理的条件下で細胞が生育できるようにする順化手順を経ました（ 25〜37℃）および培地組成（BG11培地〜DMEM）。 順応は、650 ～ 700 nm でのクロロフィル α の吸光度に基づく細胞密度の評価によって評価できます 11。 補足図2に示すように、S. obliquusとC. ellipsoideaの増殖は32°Cを超える温度で大幅に抑制されましたが、S. sp.は32°Cを超える温度で著しく抑制されました。 6803 と S. が伸びます。 7942人は気温の上昇に順応することができた。 BG11 培地から DMEM への段階的な変更により、進化した S. sp. を取得することができました。 6803 (eS. sp. 6803) 株。DMEM 中で 37 °C で活性を維持しました (補足図 3)。 したがって、この株は PMC 構築のために選択されました。 次に、結晶成長法により、異なる発光を持つ一連の UCNP を合成しました10。 Er3+ および Yb3+ ドープ NaYF4 ナノロッド（15.3 × 30.2 nm）は、原因となる顕著な成分であるクロロフィル α の吸光度に完全に一致する、660 nm で強い蛍光を発することがわかりました（補足図 4 および補足図 5）。光合成のため。 次に、静電液滴生成システムを介して静電場下で藻類微生物と UCNP をアルギン酸カルシウム微小球にカプセル化することにより、PMC を設計しました。 図 1 に示すように、プロセス全体には次の 4 つのステップが含まれます。(i) アルギン酸ナトリウム中で藻類微生物と UCNP を均一に混合する。 (ii) 静電場下でアルギン酸ナトリウム溶液を均一な液滴に分散させる。 (iii) CaCl2 溶液中の架橋アルギン酸カルシウムによって UCNP と微生物をカプセル化する。 （iv）酵素分解に耐性があり、微生物の漏出を防ぐことができる水溶性ポリカチオンであるポリ-L-リジン（PLL）によるアルギン酸カルシウムミクロスフェアのコーティング（補足図6）。 得られた PMC をアップコンバージョン発光顕微鏡で検査しました。 空のMCおよび藻類にカプセル化されたMCは蛍光シグナルを示さなかったが、PMCは980 nm励起下で強い赤色蛍光を発した（図2a）。 これらの結果は、カプセル化された UCNP がその光学特性を完全に維持していることを示しました。 我々は、PMCの光合成活性に対する微生物密度とUCNP濃度の影響を包括的に調べました（図2b）。 効率的な酸素生成 (1.6 μg/分) のために、PMC の最適化された配合 (MC あたり 3 × 103 藻細胞および 0.67 μg の UCNP) が取得されました。 指定されたPMCの酸素生成は、NIR放射線の強度と曝露時間に依存しており、制御可能な酸素供給を示しています（補足図7）。 PMCにカプセル化された藻類微生物は、DMEM中で1か月以上生存しました（補足図8）。

(i)アルギン酸ナトリウム中で藻類微生物とUCNPを均一に混合する。 (ii) 静電場下でアルギン酸ナトリウム溶液を均一な液滴に分散させる。 (iii) CaCl2 溶液中の架橋アルギン酸カルシウムによって UCNP と微生物をカプセル化する。 (iv) ポリ-L-リジン(PLL)によるアルギン酸カルシウムミクロスフェアのコーティング。

a 構築された PMC のイメージング。 空の MC、藻類細胞を含む MC (eS. sp. 6803@MC)、および完全に構築された PMC を、980 nm でのアップコンバージョン発光顕微鏡によるイメージングに供しました。 MC の端は白い輪郭で表されます。 b さまざまな配合の PMC による O2 生成を示すヒートマップ。 107 ～ 1011 細胞/mL の藻細胞、0 ～ 100 mg/mL の UCNP、および 1 mL のアルギン酸ナトリウムを混合し、静電液滴生成システムによってさまざまな PMC 配合物を調製しました。 得られた PMC を 900 mW/cm2 の NIR 放射線に 20 分間曝露し、携帯用溶存酸素計で O2 レベルを測定しました。 c DCFH染色によるPMC内で合成された酸素種の視覚化。 PMC、eS. sp. 暗所で 12 時間培養した 6803@MC および UCNP@MC を 10 μg/mL DCFH とともに 10 分間インキュベートし、その後 300 mW/cm2 980 nm の NIR 放射線に 0、1、3 および 10 分間曝露しました。 処理された微小球は、488 nm 励起での共焦点顕微鏡によって直ちに視覚化されました。 MC の端は白い輪郭で表されます。 d 腫瘍における pO2 検出を示す概略画像。 e さまざまな時点での腫瘍の中心部の酸素分圧 (pO2) の測定。 データは、3 つの腫瘍に由来する平均値 ± SD として表示されます。 f 腫瘍内の pO2 を視覚的に表示します。 Clark 酸素電極を使用して、生理食塩水、PMC、NIR、高圧酸素 (60%)、および NIR-PMC 治療を受けたマウス乳房腫瘍の pO2 を測定しました。 pO2 値は、腫瘍の深さ 5 mm で 7 日間、または腫瘍の異なる深さで NIR-PMC 処理の 1 時間後に記録されました。 腫瘍の最大断面における pO2 値は、ヒートマップの構築のために Python によって統合されました。 腫瘍の端は黒い輪郭で表されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、生理的溶液および腫瘍における PMC の酸素化能力を調べました。 PMC は最初に DMEM 中で 37 °C でインキュベートされました。 酸素は、葉緑体の光合成において他の酸素種とともに生成されることがよくあります12。 PMC における酸化ラジカルの生成は、光合成活性を評価するために 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン (DCFH) 染色によって検査されました 13。 非蛍光 DCFH は、高酸素条件下で緑色蛍光を発する 2',7'-ジクロロフルオレセイン (DCF) に酸化される可能性があります。 図2cに示すように、完全に構築されたPMCでは強い蛍光シグナルが検出されましたが、藻類やUCNPを含まないPMCでは限られたシグナルしか示されませんでした。 培地中に放出された酸素を 24 時間継続的に監視しました。 補足図9に示すように、PMCは酸素を安定して合成でき、NIR曝露後1時間で6.2±0.5mg/Lに達し、24時間で3.0±0.3mg/mLまでゆっくりと減少しました。 固形腫瘍における間質圧が 20 ～ 40 mmHg であることを考慮して 14、15、16、PMC の光合成に対する影響を調べました。 補足図10に示すように、さまざまな圧力での酸素分圧（pO2）を動的に検出するために、密閉された10 mLシリンジ、校正済みの分銅、およびクラーク電極で構成されるデバイスを設計しました。 DMEM の pO2 は通常の大気圧で 105.7 ± 6.1 mmHg に達しましたが、余分な圧力は PMC の酸素化プロファイルにほとんど影響を与えませんでした。 さらに、乳房腫瘍における PMC の酸素化を評価しました。 図2d、eに示すように、腫瘍の中心部（外層まで約5 mm）のpO2は、NIR曝露後1時間でピーク（27.2〜35.4 mmHg）に達し、ゆっくりと基礎レベル10.8〜12.3 mmHgまで低下しました。 24時。 酸素化曲線は、NIR 曝露の 7 サイクルで同様のパターンを示し、腫瘍における PMC の光合成活性が安定していることを示しました。 高圧酸素と比較して、NIR-PMC 治療では腫瘍コアの pO2 が 6.7 倍高いレベルに達しました。 ヒートマップは、腫瘍の外層から内核までの pO2 を視覚的に評価するために作成されました (図 2f)。 未治療の腫瘍（対照）の深部腫瘍では重度の低酸素症がみられましたが、NIR-PMC で治療した腫瘍の黄緑色は酸素レベルの有意な上昇を示唆していました。 これらの結果は、インビトロおよびインビボでの PMC の酸素化能力を徹底的に実証しました。

次に、PMC による O2 供給ががん細胞の増殖に影響を与えるのではないかと考えました。 PMC の効果は、乳房 (MCF-7、4T1)、肺 (A549)、肝臓 (HepG2、VX2)、腸 (HCT116)、膵臓 (PANC-1)、胃 (MGC-1) を含む 9 つの癌細胞株で評価されました。 803) および子宮頸部 (HeLa) 細胞、3 つの哺乳動物種 (ヒト、マウス、ウサギ) と 3 つの初代細胞株 (マウス胎児線維芽細胞 (MEF)、心臓および腎臓の細胞) を対象としています。 細胞の代謝活性は、MTS アッセイの比色基質によって検査されました。 NIR 放射線における熱の細胞毒性効果を防ぐために、NIR 曝露線量は 20 分間 300 mW/cm2 に設定されました (補足図 11)。 24 時間培養中の PMC に 3 回の間隔で NIR 放射線を照射し、酸素レベルが 1.8 ～ 5.3 mg/L の高酸素生体環境を作り出しました。 図3aおよび補足図12に示すように、NIRと結合したPMC（NIR-PMC）は、3つの正常細胞株に対してほとんど細胞毒性を示さなかったが、8つのがん細胞株の増殖を阻害した。 注目すべきことに、酸素十分な培地は、HCT116、HepG2、MCF-7、および 4T1 細胞の重複を完全に抑制しました。 我々は、NIR放射線の有無にかかわらず、MC、藻類、UCNPを含むPMC統合体のMCF-7細胞およびHepG2細胞への影響を詳細に包括的に調べました。 その結果、抑制効果は主にNIR-PMC処理下の細胞で検出されました（図3bおよび補足図13）。 この点をさらに実証するために、新たに合成された DNA に組み込まれ、蛍光標識できる EdU (5-エチニル-2'-デオキシウリジン) で構成される BeyoClick-iT® EdU-594 増殖アッセイ キットを使用して、新しい娘癌細胞を視覚化しました。特定のクリック反応17. 図3cに示すように、NIR-PMC処理は、EdU陽性細胞（赤色）の減少によって証明されるように、乳がん（MCF-7）細胞と肝がん（HepG2）細胞から分けられる娘細胞の割合を有意に抑制しました。 注目すべきことに、溶存酸素がN2パージによって除去されると高酸素培地は無効になり（補足図14）、藻類細胞からの代謝産物ではなく酸素がNIR-PMCの抑制効果の原因であることを示唆しています。 フローサイトメトリー分析では、アポトーシスによる細胞死がほとんどないことが示されました（補足図15）。

a 細胞増殖の評価。 PMC (25 μL、3.6 × 104/mL) の存在下または非存在下でインキュベートした HCT116、4T1、HepG2、VX2、MCF-7、PANC-1、MGC-803、HeLa および A549 細胞を 300 mW/cm2 の NIR 放射線に 3 分間曝露しました。間隔。 24 時間後、細胞生存率を MTS アッセイによって検査しました (n = 6)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 *** 両側スチューデント t 検定によると、対照細胞と比較して p < 0.001。 b PMC での統合の影響。 細胞生存率を評価するために、HepG2 細胞を MC、UCNP@MC、e-synechocystis@MC、および PMC とともに NIR 放射線の存在下または非存在下でインキュベートしました (n = 6)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 両側スチューデント t 検定によると、対照群と比較して ***p < 0.001 および **p < 0.01。 c 新しい娘細胞の共焦点視覚化。 NIR-PMC 処理後の HepG2 および MCF-7 細胞は、共焦点イメージングのために BeyoClick-iT® EdU-594 アッセイ キット (スケール バー: 20 μm) で染色されました。 d NF-κBシグナル伝達経路に対するNIR-PMCの細胞への影響。 HepG2 細胞を NIR-PMC で前処理しました (300 mW/cm2 NIR 放射線を 3 回の間隔で照射)。 24 時間後、すべての細胞を 20 nM BMS および 2 μL のジメチルスルホキシド (DMSO) (ブランク) で 2 時間前処理し、その後 200 ng/mL TNFα で 10 分間刺激しました。 細胞溶解物を収集し、IκBαおよびリン酸化IκBαのウェスタンブロッティング分析を行いました（n = 3、サンプルは同じ実験に由来し、そのブロットは並行して処理されました）。 p-IκBα 対 β-アクチンの比は、ImageJ 1.51 によって決定されました。 データは平均値 ± SD として表示されます。 *両側スチューデント t 検定によるコントロール細胞と比較した p < 0.05。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

NIR-PMC は初代細胞に対して限定的な効果しかありませんでしたが、がん細胞の増殖を大幅に抑制したため、高酸素が発がん経路のシグナルに特に影響を与える可能性があると推測しました。 核因子カッパ B (NF-κB)、ホスホイノシトール 3'-キナーゼ (PI3K)、プロテインキナーゼ B (AKT)、哺乳類ラパマイシン標的 (mTOR)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK)、および細胞外シグナル制御キナーゼ ( ERK) はがん細胞の生存と増殖に重要な役割を果たしており 18、19、20、21、免疫ブロッティングによって HepG2 細胞で検査されました。 内皮増殖因子 (EGF)、インスリン、および TNF-α が誘導剤として利用され 22、23、24、3-メチルアデニン (3-MA)、MK-2206、ラパマイシン、PD98059 および BMS-345541 (BMS) が阻害剤として含まれていました 25。 26、27、28、29、30。 図3dおよび補足図16に示すように、リン酸化IκBα（p-IκBα）の有意な抑制がPMC処理細胞で検出されました。 対照的に、NIR-PMC は ERK、PI3K、AKT、および mTOR の発現にほとんど影響を与えませんでした。 これらの結果は、増殖阻害に対する NIR-PMC の効果が主に NF-κB 経路に関連していることを示しました。 NF-κBの役割をさらに確認するために、PMCの存在または非存在下でNF-κB活性を変化させ、新しい娘細胞の染色によって細胞増殖を調べることを試みました（補足図17）。 癌細胞の増殖はBMSによって阻害されるが、PMCの非存在下ではTNF-αによって促進される可能性がある。 特に、PMCの存在下では、BMSは細胞増殖に対してより強力な阻害効果を示しましたが、TNF-αは細胞複製を促進できませんでした。

実質的な研究により、低酸素症は、がん細胞における低酸素症誘発性の HIF-1α およびアデノシン放出による腫瘍微小環境の免疫抑制と、アデノシン A2A 受容体 (A2AR) の量の増加による免疫細胞機能の阻害の原因であることが示されています 31,32 、33。 我々は、NIR-PMCによる高酸素は、低酸素/HIF-1α/アデノシン/A2AR軸を排除することによって免疫活性を高める可能性があると推測しました。 この推測を検証するために、HepG2 または MCF-7 細胞をマトリゲルにカプセル化することによって構築された癌細胞スフェロイドにおける NIR-PMC の効果を調べました。 まず、低酸素プローブ FITC-MAb1 を使用して、がん細胞スフェロイドの低酸素状態を評価しました。 図4aに示すように、未処理のスフェロイドでは強い緑色の蛍光が観察され、重度の低酸素状態を示していますが、NIR-PMC処理により酸素レベルが上昇し、低酸素状態が改善されました。 ELISA による細胞溶解物中の低酸素誘導因子 1α (HIF-1α) の定量化により、NIR-PMC 処理により HIF-1α レベルが HepG-2 細胞スフェロイドでは 335.7 から 148.3 pg/mg タンパク質に、そして 614.6 から 107.9 に劇的に減少したことが示されました。 MCF-7細胞スフェロイド中のpg/mgタンパク質（図4b）。 その結果、アデノシン産生は、MCF-7およびHepG-2細胞スフェロイドにおいてそれぞれ42.9％および71.7％減少した（図4c）。 高酸素処理後の T 細胞のエフェクター機能を評価するために、IFN-γ 産生 34,35 が検査されました。 これにより、T 細胞活性化の誘導物質としてホルボールミリステートアセテート (PMA) が含まれました。 図4d、eに示すように、PMAの非存在下では、NIR-PMCの有無にかかわらず前処理したT細胞は無視できるレベルのIFN-γのみを産生しました。 対照的に、NIR-PMC 処理グループにおける IFN-γ 産生 T 細胞の割合は、PMA の存在下で 13.5% まで著しく上昇し、NIR-PMC 前処理を行わない場合の約 2.6 倍でした。 NK 細胞の細胞溶解活性に対する NIR-PMC の潜在的な効果を試験するために、NK 細胞に非常に感受性の高い MHC 欠失マウスリンパ腫細胞株 Yac-1 を標的細胞として使用しました 36,37。 図4fに示すように、6時間の共培養後、NIR-PMC処理では最大95.6％のYac-1細胞がNK細胞によって除去され、まったく対照的に、58.3％のYac-1細胞のみが死滅しました。コントロールグループでは。 これらの結果は、NIR-PMCによって引き起こされる高酸素環境におけるT細胞およびNK細胞のエフェクター機能の再活性化を示しました。

a 低酸素状態の共焦点イメージング。 HepG2 細胞と MCF-7 細胞をマトリゲルに組み込み、スフェロイドを調製しました。 7 日間のインキュベーション後、構築されたスフェロイドを 3600/mL PMC に曝露し、300 mW/cm2 の NIR 放射線を 3 回の間隔で受けました。 処理したスフェロイドを HypoxyprobeTM-1 Plus Kit (緑色) および Hoechst 33342 (青色) で染色しました。 b 癌細胞スフェロイドにおける HIF-1α および c アデノシンの産生 (n = 3)。 スフェロイド内の細胞を収集し、ELISA および LC-MS による HIF-1α またはアデノシンの検出のために溶解しました。 d 代表的な画像および e フローサイトメトリー分析による T 細胞における IFN-γ 発現の定量化 (n = 3)。 T細胞を50 ng/mlのPMAおよび1μL/mLのゴルジ阻害剤で18時間、NIR-PMCの存在下または非存在下で3回の間隔で処理しました。 フローサイトメトリー分析のために、処理した細胞を固定、透過処理し、抗 IFN-γ-FITC で染色しました。 f NK 細胞の細胞溶解活性に対する高酸素の影響 (n = 3)。 選別したNK細胞（2×105細胞/ウェル）を24ウェルプレート中でYac-1細胞と1:1または2:1の割合で混合し、PMCの存在下または非存在下で共培養した後、3回の間隔で培養した。 NIR 曝露。 6時間のインキュベーション後、細胞混合物を収集してYac-1細胞を溶解しました。 細胞溶解物の発光をマイクロプレートリーダーで測定しました。 データは平均±SDとして表されます。 両側スチューデント t 検定による Ctrl 細胞と比較した **p < 0.01 および ***p < 0.001。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、ウサギの肝臓に PMC を in situ 移植することにより、酸素補給が肝癌に及ぼす in vivo の影響を調べました。 in vivo での安全かつ有効な放射線量を決定するために、皮膚の病理学的変化および酸素発生に対する NIR 放射線の影響を調べました。 高酸素微環境（2.7〜3.4 mg/L）を作り出し、温熱誘発性の組織損傷を防ぐため、動物の治療には20分間900 mW / cm2のNIR放射線量が選択されました（補足図18）。 PMC内のシアノバクテリアの65％以上が肝臓で少なくとも1か月間生存しました（補足図19）。 治療スキーム（図5a）に示されているように、PMC（500μL、3.6×104/mL）の腫瘍内注射を受けた肝癌担持ウサギは、980nmのNIR放射線に42日間曝露されました。 NIR-PMC治療は、HIF-1α発現の劇的な減少によって証明された、長期にわたる高酸素腫瘍微小環境を作り出しました（図5b）。 その結果、BCL2/アデノウイルス E1B タンパク質相互作用タンパク質 3 (BNIP-3)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、インスリン様増殖因子 (IGF-2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ 2 ( MMP2）およびトランスフォーミング成長因子アルファ（TGF-α）は、NIR-PMC処理後に大幅に減少しました（補足図20および補足表2）。 これらの標的はがん細胞の生存、増殖、転移において重要な役割を果たしており、その減少は腫瘍増殖の抑制を意味します38、39、40、41。

a 肝癌腫瘍を有するウサギにおける NIR-PMC 治療の図。 腫瘍移植後 14 日目（腫瘍サイズは約 1 cm3）、500 μL の PMC（3.6 × 104/mL）をウサギに腫瘍内注射し、続いて 900 mW/cm2 の NIR を 42 日間照射しました。 b 肝臓腫瘍におけるHIF-1αの免疫染色。 28日後、ウサギを屠殺し、腫瘍組織を収集した。 免疫組織化学的染色のために、組織サンプルを 4% ホルマリンで固定しました。 HIF-1α陽性細胞の割合（左パネル）は、デジタルパソロジースキャナー（DMetrix）によって計算されました。 データは、独立したウサギ肝腫瘍の 3 つの画像から得られた平均値 ± SD として表示されます。 ** 両側スチューデント t 検定によると、ビヒクル対照と比較して p < 0.01。 c 腫瘍増殖の代表的な軸方向 CT 画像。 腫瘍を有するウサギをNIR-PMCの有無にかかわらず治療した。 健康な、腫瘍を有する、NIR-PMC 処置された動物を、0、14、28、および 42 日目に CT イメージングに供しました。 肝癌腫瘍の形状/端は黄色の輪郭で示されます (スケール バー、1 cm)。 d CT画像による腫瘍サイズの測定。 肝癌腫瘍のサイズは、治療後 28 日目に Neusoft PACS/Ris V5.5 によって測定されました (n = 3)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 ** 両側スチューデント t 検定による、未治療肝癌腫瘍担持ウサギのデータと比較した p < 0.01。 e 肺腫瘍転移の代表的な軸方向 CT 画像。 動物の肺は、治療後 0、14、28、および 42 日目に CT によって画像化されました。 肺転移の小結節は黄色の矢印で示されています。 f ウサギの肺における肺転移結節の数 (n = 3)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 *両側スチューデント t 検定によると、未処理動物と比較して p < 0.05。 g 140日後の指定ウサギの生存率を示すカプラン・マイヤー曲線（n = 10）。 データは、SPSS statistics 17.0 ソフトウェアによるログランク検定に従って、未治療の肝癌腫瘍を有するウサギのデータと比較して *p < 0.05 として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

腫瘍の増殖を 42 日間の CT 画像で検査しました (図 5c)。 未治療のウサギの腫瘍サイズは、14日目には4 cm3、28日目には16 cm3まで急速に増加しましたが、NIR-PMC処理は14日間で腫瘍の増殖を完全に阻害し、28日目には腫瘍サイズが4 cm3までゆっくりと増加しました。 (図5d)。 肺は肝がん転移の最も一般的な標的臓器であるため 42、この臓器も CT イメージングによって検査しました。 図5eに示すように、未治療の腫瘍担持ウサギの肺では14日目に転移の顕著な兆候が区別でき、28日目には多数の腫瘍病巣（51±25/肺）が形成されました。 注目すべきことに、NIR-PMC治療では42日目であっても検出可能な肺転移はほとんどありませんでした（図5f、補足図21）。 一貫して、NIR-PMC治療を受けたウサギの肝臓切片は、腫瘍転移バイオマーカー血管細胞接着分子-1（VCAM-1）43の劇的な減少を示しました（補足図22）。 生存率比較のためのカプラン・マイヤープロットは、瀕死状態または自然死の時点で動物を毎日継続的にモニタリングすることによって作成されました。 ログランク試験により、媒体対照治療と比較して、NIR-PMC治療の統計的に有意な生存利益（p < 0.05）が実証されました（図5g）。 特に、CT画像およびex vivo検査では肝臓と肺に検出可能な腫瘍結節がなかったため、10匹中2匹のウサギは140日以上生存し、ほぼ治癒しました（補足図23）。 驚いたことに、発光PMCは依然として肝臓で観察され、球状形態を維持することができました（補足図23）。 これらの結果は、NIR-PMCによって作り出される高酸素微小環境が腫瘍の進行を大幅に遅らせ、腫瘍の転移を阻害し、肝癌を有するウサギの生存率を高めることができることを示した。

酸素種は免疫活性化の前提条件として広く報告されている 44 ため、NIR-PMC による長期持続的な酸素補給は、腫瘍微小環境における適応免疫応答を活性化することにより免疫療法を促進する可能性があると推測しました。 我々は、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした4T1 (fLuc-4T1) 腫瘍細胞をBALB/c マウスの胸肉に接種することにより、同所性乳腫瘍モデルにおけるアデノシンのLC-MS分析とCD4、CD39、CD206、およびCD73発現の免疫染色によってこれを検証しました。 。 図6a、bに示すように、NIR-PMC処理は腫瘍切片におけるHIF-1αとアデノシンの産生を大幅に改善し、CD4発現を増強し、CD39、CD206、CD73、およびA2AR発現を減少させました。 これは、ヘルパー T 細胞、B 細胞、NK 細胞が活性化され、腫瘍微小環境で M1 マクロファージの分化が起こったことを示しています 45,46。 したがって、NIR-PMCとチェックポイント阻害剤の併用治療では相乗的な治療効果が期待できます。 生物発光イメージング (BLI) によってスクリーニングされた腫瘍担持マウスは、無治療 (ビヒクル対照)、NIR-PMC 治療、抗 PD-1 治療 (200 μg/マウス、週 2 回) および NIR との共治療の 4 つのグループにランダムに分けられました。 -PMCおよび抗PD-1。 図 6c は、併用治療のスキームを示しています。 図6dに示すように、未治療の腫瘍担持マウスでは、4T1細胞の強力な発光および明視野画像によって急速な腫瘍増殖が検出されました。 乳がん細胞の急速な増殖は栄養欠乏と細胞壊死を引き起こし、これは腫瘍核の発光の減少によって証明されています。 NIR-PMC と抗 PD-1 の併用治療は強力な治療効果を示しましたが、NIR-PMC と抗 PD-1 治療は最初の 2 週間で腫瘍の増殖を抑制しただけで、その後急速に増殖しました。 この結果は、腫瘍体積データによってさらに確認されました。 共治療における腫瘍サイズは、抗PD-1治療における腫瘍サイズよりも3倍小さかった（図6e、補足図24）。 腫瘍の転移は動物の肺でも検査されました。 図6fに示すように、抗PD-1は腫瘍転移に対して限定的な効果しかありませんでしたが、NIR-PMC治療は切除された肺の腫瘍結節を大幅に減少させました。 注目すべきことに、共治療グループには検出可能な肺腫瘍転移は存在しなかった。 また、異なる治療における動物の生存率も比較しました（図6g）。 未治療の腫瘍担持動物はすべて、25 日以内に死亡するか瀕死の状態に達しましたが、NIR-PMC または抗 PD-1 治療により動物の生存期間が有意に延長されました (+40%)。 興味深いことに、50日間の共治療後に動物の死亡は観察されず、10匹中8匹のマウスが60日以上生存しました。 全体として、これらのデータは、PMC インプラントと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせが、乳がんを患うマウスにおいて強い相乗効果 (CI = 0.23) を示したことを示唆しています。

a 乳房腫瘍の免疫組織化学的染色 (CD4、CD39、CD206、CD73、および A2AR) の代表的な画像。 b 同所性乳房腫瘍における HIF-1α とアデノシンの産生。 腫瘍溶解物中の HIF-1α またはアデノシンは、それぞれ ELISA および LC-MS によって検出されました (n = 6 および 3)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 両側スチューデント t 検定による未治療乳がんマウスとの比較 * p < 0.05、*** p < 0.001。 c NIR-PMCと抗PD-1による併用治療の概略図。 腫瘍移植後 7 日目 (腫瘍サイズ約 100 mm3) に、PMC (25 μL、3.6 × 104/mL) を腫瘍担持マウスに腫瘍内注射し、続いてマウスに 300 mW/cm2 の NIR 放射線を 28 分間照射しました。日々。 PMC の 1 回の注射は、腫瘍治療手順全体にわたって投与されました。 各マウスには、10 mg/kg の抗 PD-1 を週に 2 回投与されました。 d 乳癌担持マウスの生物発光画像（BLI）および明視野画像（BF）。 さまざまな治療薬を投与された動物を、0、7、14、21、および28日目にカメラおよびIVISイメージングスペクトルシステムによる生物発光イメージングに供した。 e, マウスの平均腫瘍増殖曲線。 個々のマウスの腫瘍体積をノギスで 2 日ごとに 20 日間測定しました (n = 6)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 *** 両側スチューデント t 検定によると、未治療の乳がんマウスと比較して p < 0.001。 f 肺転移の ex vivo イメージング。 肺の転移性結節を視覚化するために、さまざまな治療を受けた動物を 21 日目に屠殺しました。 肺転移の小結節は黒い輪郭で示されています。 g 60日後の指定マウスの生存率を示すカプラン・マイヤー曲線（n = 10）。 データは、ＳＰＳＳ統計１７．０ソフトウェアによるログランク検定に従って、未治療の肝癌腫瘍を有するウサギのデータと比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

動物における NIR-PMC の生物学的安全性を評価するために、PMC を健康なマウスに腹腔内または皮下注射により投与し、NIR 放射線に曝露しました。 動物組織は組織学的検査のために収集されました。 補足図25に示すように、H&E染色は、テストしたすべての臓器で無視できる病理学的変化を示し、TUNEL染色は皮膚切片に壊死性細胞死がないことを示しました。 血液検査の結果、注射後 1 日目または 3 日目には血小板、好中球、単球の変化が限定的であることが示されましたが、8 日目にはすべて回復しました。 これらの結果は、PMC の生物学的安全性を十分に実証しました (補足表 4 および補足表 5)。

腫瘍の治療戦略は、発がんメカニズムの理解に依存しています。 体細胞選択は発がんの顕著な原因としてしばしば認識されていますが、変異細胞を排除するための化学療法や物理療法の発見を目的とした研究が数多く行われています 7,47。 何百万人ものがん患者が腫瘍の死滅により寿命を延ばすことに成功しましたが、副作用、薬剤耐性48、腫瘍転移49が大きな障害となっています。 このため、がん治療戦略の再考が必要となっています。 低酸素腫瘍微小環境を改善するために、大きな研究関心が集まっています。 高圧室は、血中酸素濃度を上昇させるための診療所の従来の設備です。 1775 年にジョセフ プリーストリーによって発見されましたが、最初の治療応用は 150 年後に減圧症に行われました50。 その後、これらの施設は心臓手術51、感染症52、腫瘍治療53にも使用されました。 しかし、標的組織に対する特異性が低く、高圧酸素の効率が低いため、がん患者への適用は制限されています53。 これらの限界を克服するために、腫瘍に酸素を特異的に送達する薬物担体が研究されました。 たとえば、Liang et al. O2@PFOB@PGL ナノ粒子は、顕著な酸素貯蔵庫として機能し、低酸素腫瘍に効果的に酸素を供給して、光線力学療法を強化する可能性があります 54。 白金ベースのナノ粒子は内因性 H2O2 と反応して腫瘍部位内に O2 を生成し、併用療法の低酸素微環境を改善する可能性があります 55,56。 高い酸素負荷能力を示す合成材料であるパー​​フルオロカーボン (PFC) は、低酸素腫瘍微小環境で酸素を放出することができました 57。 ただし、これらのアプローチは一時的な O2 補給を提供するだけです。 今回我々は、UCNPと藻類をマイクロカプセルに封入することにより、スマートなマイクロ酸素工場を構築した。 報告されている酸素供給戦略とは異なり、結果として得られた PMC は近赤外レーザーを活用して藻類の光合成を制御し、長期にわたる酸素補給を可能にしました。 NIR は毎日動物に適用されますが、腫瘍内の pO2 は NIR 曝露後 1 時間でピーク (27.2 ～ 35.4 mmHg) に達し、24 時間で低酸素状態 (10 mmHg) に戻りました。 定期的な酸素補給は、がん細胞の代謝ネットワークと表現型に影響を与える可能性があり、その後の研究で考慮する必要があります。 これに関して、腫瘍内の低酸素微環境の長期にわたる拮抗作用により、細胞の複製が抑制され、腫瘍の進行が遅くなる可能性があります。 肝癌腫瘍を有するウサギでの我々の所見は、殺腫瘍剤が含まれていなかったため、この仮説を裏付けた。 注目すべきことに、試験した10匹の動物すべてにおいて、2匹のウサギは無治療の動物（平均生存期間約27日）よりも5倍長く（＞140日）生存し、検出可能な腫瘍節もなかったことから、癌が発生しなかった。 ただし、これらの所見は、さまざまな腫瘍モデルにわたってさらに検証する必要がある可能性があります。

早期（ステージ 0）または早期（ステージ I）のどのステージでも、がん患者の 30 ～ 40% が手術が第一選択です 58,59 が、PMC は単独で投与される場合もあれば、経動脈化学塞栓療法（TACE）の効果と相乗的に作用する場合もあります。中期または後期（>ステージ II）のがん患者に対する介入療法、免疫療法、標的療法を実施して、局所制御と緩和を確立します。 PMC は介入装置に対応できるように意図的に設計されています。 動物への PMC の投与には腫瘍内注射が選択されましたが、PMC は経カテーテル動脈化学塞栓術によってヒト患者にも適用できます。 将来の臨床応用を促進するには、NIR 放射線の線量と継続時間を慎重に検討する必要があります。 肝癌を例に挙げると、ウサギに 980 nm で 900 mW/cm2 の NIR 放射線を 1 日あたり 60 分間照射しました。 ウサギの肝癌の深さが 0.3 ～ 0.7 cm であることを考えると、動物の腹部に侵入した腫瘍は 300 ～ 500 mW/cm2 の放射線を受けました 60。 ヒト患者でこのような励起強度を得るには、放射線量を 2000 mW/cm2 に増やすか、継続時間を 180 分に延長する必要があります。これは、ヒト患者の肝癌はウサギよりも深いことが多いからです61、62、63。 980 nm の NIR 放射の強度は、人間の腹部 0.7 ～ 1.0 cm の組織を透過すると 30% 未満に低下します。 ただし、この量の NIR 放射線は温熱障害を引き起こす可能性があります。 あるいは、NIR-II 光子は 980 nm の NIR レーザーよりもはるかに深い透過能力を持っているため、1200 ～ 1700 nm の NIR-II 放射線が臨床応用に適しています64。 NIR-II 領域の励起を持つ UCNP は、臨床での潜在的な応用のための PMC を構築するために利用される可能性があります。 介入療法は肝がん患者における従来の治療法であるため、PMC は臨床応用に有望なインプラントです。

肝癌モデルに加えて、乳癌担持マウスにおける PMC の効果を調べました。 PMC のさまざまな成分の効果が包括的に検査されました。 in vitroの結果（図3b）と一致して、治療効果は主にNIR-PMC治療を受けた動物で観察されました（補足図26および補足図27）。 腫瘍におけるPMCの生体内分布は、発光の視覚的観察によって調べられ、それらの位置にはほとんど変化がありませんでした（補足図28）。 酸素は、M2 腫瘍関連マクロファージ (TAM) の M165 への分化や、スーパーオキシドラジカルの合成による T 細胞 66 および NK 細胞の活性化 67 などの抗腫瘍免疫応答を活性化することが報告されています。 ハットフィールドら。 がん免疫療法を改善したり、他の腫瘍治療と相乗効果を発揮するために、酸素化剤によって低酸素/HIF-1α/アデノシン/A2AR軸を排除することを提案しました31,44。 私たちの研究は、NIR-PMC が低酸素状態を大幅に改善し、がん細胞スフェロイドおよび乳房腫瘍における HIF-1α およびアデノシンの産生を阻害できることを実証しました。 さらに、NIR-PMC による高酸素状態は、in vitro での IFN-γ 産生および細胞溶解能の観点から、T 細胞および NK 細胞のエフェクター機能を再活性化する可能性があります。 NIR-PMC で処理した腫瘍では、A2AR 発現は低下していましたが、CD4 発現は増強されており、乳房腫瘍における抗がん免疫応答の増強の発生が示唆されています。 NIR-PMC と免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは、乳房腫瘍担持マウスにおいてかなりの生存上の利点を示しました。 これらの結果は、Hatfieldらによって提案された治療戦略を強く支持しました。

腫瘍の転移は、がんの転移を伴う複雑なプロセスです。 上皮間葉移行。 FAT168、リボソームタンパク質69、膜貫通タンパク質CCDC2570、Nrf271、およびE-カドヘリン72を含むいくつかの生体分子が、転移の進行を制御することが最近発見された。 さらに、強力な微小環境因子として、低酸素は転移カスケード内の複数の段階（浸潤、遊走、血管内侵入、血管外遊出など）を促進することが報告されています1。 腫瘍転移はがん患者の治療失敗の主な原因であり、がん関連死亡率の 90% の原因となっている 73 が、臨床介入はほとんどありません。 しかし、この研究で構築された生体内酸素工場は、腫瘍転移抑制のためのがん治療に利用できる可能性がある。 PMC インプラントは、同所性乳がんおよび移植肝がんモデルにおける腫瘍転移を劇的に予防しました。 NIR PMC によって作られる高酸素微小環境は、転移シグナルに拮抗することでがん細胞の浸潤をブロックする可能性があります 74。

要約すると、我々はシアノバクテリアとUCNPをアルギン酸ポリリジンマイクロカプセルに封入することにより酸素工場(PMC)を構築することに成功した。 PMC は、NIR 放射下での光合成を可能にし、生物学的状況において長期持続的かつ制御可能な酸素化を提供しました。 PMCによって補充されたO2は、癌細胞におけるHIF-1α産生とNF-κB活性化を阻害し、非毒性の方法で癌細胞の複製を劇的に防止した。 同所性肝癌および乳癌における PMC の移植によって in vivo の高酸素微小環境が形成され、腫瘍の増殖と転移が大幅に抑制されました。 PMC インプラントとチェックポイント阻害剤 (抗 PD-1) の同時治療を受けたマウスの乳がんでは、強力な相乗効果が実証されました。 全体として、我々の発見は、腫瘍進行に対する高酸素微小環境の抑制効果を実証した。

抗ホスホ IκBα (カタログ番号 9246)、抗 IκBα (カタログ番号 4814) を含む、この研究におけるウェスタンブロット用の抗体は、Cell Signaling Technology Inc. (ボストン、マサチューセッツ州、米国) から購入しました。 3-メチルアデニン (HY-19312)、MK-2206 (HY-10358)、ラパマイシン (HY-10219)、PD98059 (HY-12028)、および IL-2 (HY-P7077) は MedChemExpress (ニュージャージー州、米国) から購入しました。 。 ポリ-L-リジン (MW: 15000 ～ 30000、P4832)、BMS-345541 (カタログ番号 401480)、PMA (P1585)、および抗β-アクチン抗体 (A2066) は、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から購入しました。 、米国）。 抗 PD-1 は BioXCell (BE0146、レバノン、米国) から購入しました。 MTS アッセイキットは Promega (米国ウィスコンシン州マディソン) から購入しました。 ペニシリン、ストレプトマイシン、トリプシン-EDTA、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）およびRPMI-1640培地は、Hyclone Laboratory（米国ユタ州サウスローガン）から購入しました。 抗 AKT (bsm-33278M) は Bioss (北京、中国) から購入しました。 抗 PI3K (AF6241)、抗ホスホ PI3K (AF3242) は Affinity Biosciences (USA) から購入しました。 インスリン、Hoechst 33342、RIPA ライセート、DCF-H、SYBR Green アッセイ キット、LIVE/DEAD 染色キット、および Click-iT®EdU-594 アッセイ キットは、Thermo Fisher Scientific (米国ニューヨーク州グランド アイランド) から購入しました。 TNF-α 組換えタンパク質 (ab9642)、EGF (ab9697)、抗ホスホ AKT (ab38449)、抗 mTOR (ab134903)、抗ホスホ mTOR (ab109268)、抗 ERK (ab32537) および抗ホスホERK (ab214036) はアブカム (中国、上海) から購入しました。 5-FU (F100149) は Aladdin (上海、中国) から購入しました。 HIF-1 α 染色キットは R&D (米国ミネソタ州) から購入しました。 ゴルジ阻害剤 (カタログ番号 554724)、Cytofix/Cytoperm バッファー (カタログ番号 554722)、Perm/Wash バッファー (カタログ番号 554723)、および抗 IFN-γ-FITC (カタログ番号 554411) は、BD (Biosciences、マサチューセッツ州ベッドフォード) から購入しました。 ）。 抗マウス CD28 (カタログ番号 102102) 抗体および抗マウス CD3 抗体 (カタログ番号 100302) は Biolegend (中国、上海) から購入しました。 HypoxyprobeTM-1 Plus Kit は HPI Inc. (米国マサチューセッツ州バーリントン) から購入しました。 アネキシン V-FITC/PI アポトーシス細胞死アッセイ キット (abs50001) は、Absin Bioscience Inc (上海、中国) でした。 IL-15 (CLY200-07AF) は Cedarlane (カナダ) から購入しました。 塩酸キシラジンは、Shengda Animal Products Co., Ltd (吉林省、中国) から購入しました。 PC 膜 Transwell-24 (カタログ番号 3422) および Matrigel Matrix は、Corning (NewYork, USA) から購入しました。 Blue Green Algal 細胞増殖培地 (BG-11) は、水力生物学研究所 (中国、武漢) から入手しました。 アルギン酸ナトリウム（分子量、460 kDa; マンヌロン酸とグルロン酸のモル比、2/1）は、Qingdao Bright Moon Seaweed Group Co., LTD（青島、中国）から購入しました。 アップコンバージョンナノ粒子 (NaYREF4、RE:Yb、Er@NaYF4) は、報告されている方法 75 に従って合成されました。 他のすべての試薬は分析グレードでした。

天然シネコシスティス sp. 6803 (カタログ番号 FACHB-898)、Synechococcus elongates 7942 (カタログ番号 FACHB-805)、Scenedesmus obliquus (カタログ番号 FACHB-417) および Chlorella ellipsoidea (カタログ番号 FACHB-40) は水文学研究所から入手しました (中国武漢）は、温度（25〜37℃）や培地組成（BG11からDMEM）などの生育条件を段階的に変更することにより、生理的条件への順応のための選択的進化を受けました。 培養温度と培地組成は、生理学的条件下で生存するための微生物の進化を可能にするために徐々に変更されました76、77、78。 詳細には、定常期の藻類微生物 3 mL (1.0 × 108 細胞/mL) を、通気キャップ付きバッフル底フラスコ (カタログ番号 4116-0125、Thermo Fisher Scientific Inc.) 内のシェーカー内で 10 mL の BG11 培地に分散させました。培養条件を段階的に変化させます。 25℃で培養した藻類微生物を対照として使用した。 細胞増殖は式1を使用して計算されました。 (1) 660 nm での光学濃度値 (OD660) を検出することにより:

ここで、VAT と VmT は、それぞれ試験条件における藻類微生物と培地の OD660 値です。 VAとVMはそれぞれ通常の培養条件（25℃）における藻類微生物とBG11培地のOD660値です。

細胞がテスト温度に適応し、85%を超える細胞増殖を示したら、培養温度を上げました (1 °C)。 それ以外の場合は、温度をさらに 24 時間維持しました。 30 日間の培養後、進化した藻類微生物を取得し、その後のテストのために BG11 培地中で 37 °C で保存しました。 次に、培地組成をBG11からDMEMに段階的に変更して上記の手順を繰り返しました。 進化したシネコシスティス sp. DMEM中37℃で培養した6803をeSと表記した。 sp. 6803。

エス。 sp. 6803 を 1000 × g で 10 分間遠心分離 (Centrifuge 5810 R、Eppendorf) して 50 mL チューブに収集し、PMC 構築のために PBS に再懸濁しました。 懸濁した細胞を、1.5重量%のアルギン酸ナトリウム溶液中で所望の濃度のUCNPと混合した。 ボルテックス後、混合物を静電液滴発生器を用いて０．５ｍｍ針を通して０．１Ｍ ＣａＣｌ２溶液（ゲル化浴）中に押し出し、アルギン酸−Ｃａビーズを調製した。 ビーズを０．０５重量％ポリリジン溶液（体積比１：１０）に１０分間浸漬して、ポリリジンコーティングを形成した。 コーティングされたマイクロカプセルを５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、顕微鏡下で計数した。 すべての新たに作成した PMC は、さらなる使用のために 37 °C の照明インキュベーター (HerryTech KE-200、上海、中国) で培養されました。

PMC の形態とサイズは顕微鏡 (FV1200、オリンパス、東京、日本) によって測定されました。 空の MC、eS。 sp. 6803@MC および PMC を 3600/mL で 8 ウェル チャンバーに添加し、980 nm レーザー励起で 20 倍の対物レンズを備えたアップコンバージョン共焦点顕微鏡によるフォトルミネッセンス活性の評価を行いました。 UCNP のフォトルミネセンス スペクトルは、Edingbour NanoSpectralyzer 蛍光分析装置 (Applied NanoFluorescent、FLS980) で測定しました。 酸素放出プロファイルを取得するために、3600/mL で新たに作成した PMC を 10 mL の無酸素水に懸濁し、CO2 を還流しながら 1 時間真空抽出 (1.45 × 10−3 psi) を行いました。 透明なエッペンドルフチューブに入った PMC 懸濁液 (10 mL) を、0、100、300、900 mW/cm2 の 980 nm 放射線に 0 ～ 60 分間曝露しました。 ポータブル溶存酸素計 (JPB-70A 酸素センサー、Qiwei Instrument Co., Ltd.、杭州、中国) を適用して溶存酸素濃度を記録しました。 UCNP@MC を含む懸濁液もブランクとして含めました。

HCT116、HepG2、VX2、MCF-7、PANC-1、MGC-803、4T-1、HeLa、および A549 細胞は ATCC (USA) から購入しました。 私たちの研究では、HeLa 細胞を認証するために STR 分析を実行しました。 STR 遺伝子座は、超可変領域に隣接する蛍光標識された PCR プライマーを使用して増幅されます。 結果は、私たちの研究で使用されたHeLa細胞がATCCのHeLaと一致することを示しました（補足表6）。 Yac-1 細胞は、National Collection of Authenticated Cell Caltures (中国、上海) から購入しました。 MEF (マウス胎児線維芽細胞) 細胞は、Sudan He 博士 (中国医学科学院蘇州システム医学研究所) から寄贈されました。 初代心臓細胞と腎臓細胞は BALB/c マウスから取得しました。 詳細には、解剖したマウスの心臓と腎臓を小片（<3 mm）に切断し、冷PBS（4℃）で十分に洗浄して血球を除去し、心臓または腎臓の解離キット（ Bio-leader Inc、江西省、中国）。 チューブを組織解離器 (Bio-leader Inc、江西省、中国) のスリーブに固定し、100 g で 1 分間粉砕 (30 秒オン、30 秒オフ) した後、37 °C で 60 分間酵素消化しました。 細胞懸濁液を濾過（70μm）により収集した。 心臓および腎臓の細胞ペレットを計数し、細胞培養培地に再懸濁しました。 すべての細胞株は、10% ウシ胎児血清 (Gemini、ウッドランド、米国)、100 U/mL ペニシリンおよび 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した DMEM 培地または RPMI-1640 培地で、37 °C、5% CO2 または低酸素条件で培養しました ( 2% O2 および 5% CO2)。

試験した細胞を96ウェルプレートに5×103/ウェルで播種し、一晩インキュベートした後、25μLのPBS、空のMC、UCNP@MCおよびPMC（25μL、3.6×104/mL）を添加しました。 細胞と PMC を、2% O2 および 5% CO2 の加湿低酸素雰囲気中で、37 °C で 24 時間、300 mW/cm2 の NIR 照射を 3 回照射するか照射せずに培養しました。 上清と残留 PMC を除去した後、120 μL の希釈 MTS 作業溶液のアリコートを各ウェルに添加し、37 °C でさらに 2 時間インキュベートしました。 マイクロプレートリーダー（Synergy NEO HTS、Biotek、USA）によるOD 490 nmでの吸光度検出のために、上清を新しいプレート（100μL/ウェル）に移しました。 細胞生存率は式によって決定されました。 2:

ここで、AN、AC、および AB は、それぞれ処理済み細胞、未処理細胞、およびブランクサンプルにおける 490 nm での MTS 基質の吸光度を表します。

選別したNK細胞（2×105細胞/ウェル）を、PMCの存在下または非存在下でfLuc-Yac-1（マウスリンパ腫）細胞と1:1または2:1の比率で共培養し、その後3回の間隔で培養しました。 NIR 曝露の影響。 6時間のインキュベーション後、細胞混合物を収集し、100μLのGlo溶解緩衝液（カタログE266A、Promega、WI、USA）によってYac-1細胞を溶解した。 その後、50 μL/ウェルの One-Lite® ルシフェラーゼ アッセイ システム (カタログ DD1203-01、Vazyme、南京、中国) を添加して、マイクロプレート リーダーで細胞溶解物の発光を測定しました。 Yac-1 細胞の発光を測定して細胞死の割合を決定し、これを使用して NK 細胞の細胞溶解活性を評価しました 79。 細胞死のパーセンテージは式によって決定されました。 3:

ここで、IoおよびIlysateは、それぞれ未処理細胞およびNK細胞と共培養した細胞における細胞溶解物の発光強度を表します。

マトリゲル マトリックス (1.5 mL) を 4 °C の氷浴で解凍し、0.5 mL の HepG2 または MCF-7 細胞懸濁液 (予冷 DMEM で 4 × 106 細胞/mL) と混合しました。 気泡の発生を避けるために溶液を穏やかに混合した。 300 μL の懸濁液のアリコートを、予冷した 24 ウェル プレートまたは 35 mm 共焦点ディッシュに加えました。 プレートまたはディッシュを 37 °C で 30 分間培養してマトリックスを重合させた後、さらに培養するために各ウェル/ディッシュのゲルの上部に 1 mL の DMEM を添加しました。 細胞凝集体のサイズが 50 μm を超えると、7 ～ 10 日間の培養後に成熟癌細胞スフェロイドが取得されました。

２４ウェルプレート中の処理されたスフェロイドを、細胞回収溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）によって氷上で液化させた。 500×gで5分間の遠心分離によって細胞スフェロイドを回収し、PBSで洗浄し、液体窒素中で凍結融解サイクルを3回繰り返すことによってPBS（50μL）中で溶解させた。 新鮮な腫瘍の重さを量り、50 mg のサンプルを 100 μL PBS 中で 4 °C でホモジナイザー (OSE-Y30、TIANGEN、中国) によって解離させました。 ホモジナイズした組織溶液と細胞溶解物を 500 × g で 5 分間遠心分離して破片を除去しました。 上清中のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって検出されました。 アデノシンまたはサイトカイン分析のために、溶解物を -20 °C で保存しました。

レーザー装置 (Xi'an Lei Ze Electronics Tech Co., Ltd、山西省、中国) を使用して、0 ～ 900 mW/cm2 の 980 nm レーザーによって PMC での光合成を促進するための NIR 放射を提供しました。 10 mL 培地 (PBS、BG11 または DMEM) 中の PMC を透明なエッペンドルフ チューブに入れ、100 ～ 900 mW/cm2 の NIR レーザーに 0 ～ 60 分間曝露しました。 マルチウェルプレートまたは共焦点ディッシュで増殖させた細胞およびスフェロイドを、3 つの間隔で 300 mW/cm2 の NIR 放射線に曝露しました (各間隔で 20 分間、15 分間オンおよび 5 分間オフ)。 腫瘍を有するマウスとウサギを毎日、それぞれ 300 mW/cm2 と 900 mW/cm2 の NIR 放射線に 3 回の間隔 (各間隔 20 分、15 分間オンと 5 分間オフ) に曝露しました。

PMC における酸素生成を視覚化するために、DCFH 染色キットを使用して酸素生成を視覚化しました。 PMC、eS. sp. 6803@MC および UCNP@MC を 1500/ウェルで、35 mm 共焦点ディッシュ内の 1 mL DMEM 培地で、暗所、37 °C で 12 時間培養しました。 次に、処理した PMC を 10 μg/mL DCFH とともに 10 分間インキュベートし、その後 300 mW/cm2 980 nm の NIR 放射線に 0、1、3 および 10 分間曝露しました。 DCF の蛍光は、488 nm 励起での共焦点顕微鏡により直ちに視覚化されました。

低酸素状態を評価するために、35 mm 共焦点ディッシュ内の成熟 HepG2 および MCF-7 細胞スフェロイドを、PMC 懸濁液 (DMEM 中 4500/mL) の有無にかかわらず、1 mL の新鮮な DMEM で培養しました。 次に、回転楕円体を 300 mW/cm2 の NIR 放射線に 3 回曝露しました。 その後、スフェロイドを 100 μM 塩酸ピモニダゾールとともに 37 °C で 12 時間インキュベートし、PBS で洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで室温で 30 分間固定しました。 スフェロイド内の細胞を PBS 中の 0.5% Triton X-100 で 1 時間透過処理し、PBS 中のマウス IgG1 モノクローナル抗体に結合した 0.5 μg/mL FITC (FITC-MAb1) および 10 μg/mL Hoechst 33342 で 6 時間染色しました。 PBS中で室温で30分間。 染色された細胞は、励起波長405 nmおよび488 nmでの顕微鏡イメージングのためにPBSで3回洗浄されました。

新しい娘細胞のイメージングでは、4500/mL PMC の有無にかかわらず前処理した HepG2 および MCF-7 細胞を 3 回の間隔で NIR 放射線に曝露しました。 処理した細胞を1 ng/mL TNF-αで12時間、または40 μM BMSで12時間インキュベートしました。 その後、上清を Click-iT®EdU-594 アッセイ キット内の 500 μL EdU 作業溶液 (10 μM) に置き換えました。 さらに 37 °C で 2 時間培養した後、細胞を 4% ホルムアルデヒドで室温で 30 分間固定し、PBS 中の 0.5% Triton X-100 で 20 分間透過処理しました。 上清を除去し、3% BSAで3回洗浄した後、860μLの反応緩衝液、40μLのCuSO4、2μLのアジド594および100μLのクリック添加剤溶液を含むクリック反応カクテルを新たに調製し、透過処理した細胞に加えた。 室温で３０分間反応させた後、反応カクテルを除去した。 細胞をＰＢＳ中３％ＢＳＡで２回洗浄し、核染色のために０．５ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。 10 分間のインキュベーション後、標識された細胞サンプルを共焦点顕微鏡 (FV1200、オリンパス、日本) によって視覚化しました。

HepG2 細胞を 6 × 105 細胞/ウェルの密度で 6 ウェルプレートに播種しました。 一晩インキュベートした後、細胞を 1.2 × 104/mL PMC の存在下または非存在下で 3 回の間隔で NIR 放射線に曝露し、続いて TNF-α (200 ng/mL)、EGF (200 ng/mL) およびインスリンとインキュベートしました ( 100nM）10分間。 その後、上清を新しい培地、またはさらなるインキュベーションのために、20 μM BMS 2 時間、2 mM 3-メチルアデニン 1 時間、4 μM MK-2206 4 時間、100 nM ラパマイシン 4 時間などの阻害剤を含む培地と交換しました。または100μM PD98059を2時間。 PBS で十分に洗浄した後、細胞ペレットを収集し、溶解バッファー (10% グリセロール、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM Na3VO4、1% Triton X-100、25 mM β-グリセロール) に懸濁しました。リン酸塩、0.1 mM フェニルメタンスルホニルフルオリド) と 2% カクテルホスファターゼ (カタログ: P5726、Sigma) および 5% プロテアーゼ (カタログ: P5147、Sigma) 阻害剤。 細胞懸濁液を 10 秒間ボルテックスし、その後氷上で 30 分間インキュベートし、続いて 2000 × g で 20 分間遠心分離しました。 上清中のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイによって測定および調整した。 サンプルは、Mini-PROTEAN Tetra System (Bio-Rad、カリフォルニア州、米国) のランニングバッファーとしてトリス-グリシン-SDS バッファーを使用し、100 V で 8 ～ 15% SDS-PAGE ゲル (Beyotime、上海、中国) 上で分離されました。 300 mA でニトロセルロース膜に転写しました。 メンブレンを、0.1% Tween 20/PBS 中の 5% ミルク (Biofrox、アインハウゼン、ドイツ) で室温で 2 時間ブロックし、その後、IκBα (1:1000)、リン酸化 IκBα (1:1000)、PI3K ( 1:500)、リン酸化PI3K (1:500)、AKT (1:1000)、リン酸化AKT (1:1000)、mTOR (1:10000)、リン酸化mTOR (1:10000)、ERK (1:1000)、リン酸化 ERK (1:1000) および β-アクチン (1:5000) 抗体を 4 °C で一晩反応させます。 TBS中の0.1% v/v Tween 20 (洗浄緩衝液)で3回洗浄し、HRP結合二次抗体(1:5000)とともに室温で2時間インキュベートした後、膜を十分に洗浄した。 新たに調製した ECL 高感度化学発光溶液を使用して、多色蛍光化学発光イメージング分析システム (FluorChem M、Alpha、USA) によって膜をイメージングしました。

0.1 ～ 0.4 mg のタンパク質からなるスフェロイド (50 μL) および腫瘍 (100 μL) サンプル ライセートを 1 mL の予冷メタノールと混合し、-20 °C で 16 時間インキュベートしました。 混合物を 20,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離して、タンパク質沈殿物を除去しました。 上清中の代謝産物を、加圧ガス吹き込み濃縮装置 (VSD150-2、Woxin Instrument Manufacturing Co.、中国) で N2 で乾燥し、150 μL の緩衝液 A (脱イオン水中の 0.1% ギ酸) に再溶解しました。 バッファー A に 0 ～ 1000 nM で溶解したアデノシン標準も調製しました。 5 μL サンプルのアリコートを C18 逆相カラム (2.1 mm × 150 mm、100 Å、3.5 μm) に注入し、分離しました。 LC-MS 分析は、LTQXL 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) と組み合わせた Agilent 1100 シリーズ LC システム (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) で実行されました。 移動相は、70% のバッファー A と 30% のバッファー B (100% ACN) からなる定組成システムによってプログラムされました。 流速は300μL/分に維持した。 MRM MS 検出を陽イオン化モードで操作してデータを収集しました。 MS 検出は、3 kV の電源電圧および 350 °C のキャピラリー温度で実行されました。 シースおよび補助ガスの流量は、それぞれ 55 arb および 15 arb に設定されました。 MSデータはXcaliburソフトウェアによって分析されました。 試験サンプル中のアデノシンの濃度は、その標準曲線によって決定されました。

NIR-PMC 処理がアポトーシス細胞死を誘導するかどうかを調べるために、HepG-2 細胞 (5 × 105 細胞/ウェル) を 6 ウェルプレートに播種し、DMEM で 16 時間培養しました。 次に、上清を新しい培地、または 500 μg/mL 5-FU または PMC を 3600/ウェルで含む DMEM と交換し、3 回の間隔で NIR に曝露しました。 24 時間のインキュベーション後、フローサイトメトリー分析の前に、細胞を収集し、メーカーのプロトコールに従ってアネキシン V-FITC/PI 染色キットによって染色しました。

T細胞のIFN-γ産生に対するNIR-PMC処理の効果を調べるために、細胞内染色アッセイを実施した。 CD3 および CD28 抗体で事前活性化したマウス T 細胞を 10% FBS を添加した RPMI-1640 に再懸濁し、24 トランスウェル プレート (2 × 106 細胞/ウェル、2 mL) の下部チャンバーに 50 ng/mL で播種しました。 PMA および 1 μL/mL ゴルジ阻害剤。 PMC を、PC メンブレン上の 8.0 μm 細孔サイズの上部チャンバー (3600/ウェル) に添加しました。 次に、培養物全体を 3 回の間隔で NIR 放射線に曝露しました。 18 時間後、細胞を 700 g で 5 分間遠心分離し、ペレット化した細胞を BD Cytofix/Cytoperm バッファーで 30 分間固定しました。 固定した細胞を BD Perm/Wash バッファー (カタログ番号 554723、BD Biosciences) で 1 回洗浄し、その後細胞を 5 μL/テスト抗 IFN-γ-FITC (カタログ番号 554411、BD Biosciences) を含む BD Perm/Wash バッファーに再懸濁しました。 BD Biosciences）、室温で 30 分間インキュベートします。 BD Perm/Wash バッファーで 3 回洗浄した後、再懸濁した細胞をフローサイトメトリー (FACSVerse、BD) 分析に供しました。 データ解析にはFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を使用しました。

メスの BALB/c マウス (6 ～ 8 週齢、約 20 g) を、中国の南京にある Gempharmatech Co. Ltd の実験動物センターから入手しました。 メスのニュージーランド白ウサギ (生後 6 ヶ月、体重 2 ～ 2.5 Kg) を Qingdao Kangda Rabbit Co., Ltd. (青島、中国) から入手しました。 すべての動物は、ろ過された空気条件（22 ～ 25 °C）、12 時間の暗/明サイクル（8:00 ～ 20:00 明、20:00 ～ 8:00 暗）および相対湿度（ 40〜70%）をプラスチック製のケージに入れ、寝具用の滅菌木材の削りくずを入れます。 すべての動物実験は、蘇州大学の実験動物の動物管理委員会によって承認された中国動物管理評議会のガイドラインに従って厳密に実行されました（番号 ECSU-202109A0401）。 承認された人道的エンドポイントは、以下の基準のいずれかを満たした腫瘍担持動物に適用されました。(i) マウスの腫瘍直径が > 2 cm、またはウサギの腫瘍体積が > 80 cm3 である。 (ii) 動物の飲食または移動が重大な影響を受ける。 ウサギで肝臓 VX2 腫瘍を発生させるために、VX2 細胞懸濁液 (2 × 106 細胞、200 μL) をドナーウサギの大腿筋に移植しました。 腫瘍サイズが > 2 cm (約 2 週間) になったら、腫瘍組織を採取するために致死量 2 mL/Kg の塩酸キシラジンを静脈内注射してドナーウサギを麻酔しました。 各腫瘍を無菌条件下で眼科用ハサミで１ｍｍ３の小片に切り刻んだ。 レシピエントウサギを塩酸キシラジン(250μL/Kg)の筋肉内注射により麻酔した。 細かく刻んだ組織断片を、16 スライス CT スパイラル スキャン (Brilliance-16、フィリップス、米国) ガイダンス下の経皮穿刺技術によって、レシピエントウサギの肝左葉の被膜下実質に経皮的に直接送達しました。 ウサギを飼育し、腫瘍体積が約 1 cm3 に達するまで CT 画像検査を行いました。 同様の腫瘍サイズを有する肝癌担持ウサギを、サイコロを振ってビヒクル対照（n = 13）、NIR-PMC グループ（n = 13）の 2 つのグループに分けました。 14 日目に、ウサギに PMC 懸濁液 (500 μL、3.6 × 104/mL) を 1 回腫瘍内注射するために麻酔をかけました。 900 mW/cm2 の NIR 放射線を毎日 3 回の間隔で動物に曝露しました (各間隔は 20 分)。 腫瘍サイズは 2 週間ごとに CT スキャン (MHCT brilliance 16、フィリップス、オランダ) によってモニタリングされました。

Zhimou Yang博士（中国天津の南開大学）から提供されたfLuc-4T1細胞を2×108細胞/mLで100μLのPBSに懸濁し、各動物の乳房脂肪体に注射した。 腫瘍体積を 2 日ごとに検査し、式 1 によって計算しました。 4:

腫瘍サイズが約 50 mm3 に達したら、4T-1 細胞を接種したマウスをさらなる治療のために収集しました。 適格なすべての動物を、25 μL 生理食塩水の腫瘍内注射（溶媒制御）、300 mW/cm2 NIR と組み合わせた 25 μL 生理食塩水中の 3.6 × 104/mL PMC の腫瘍内注射を含む、以下の治療のためにサイコロを振ることによってランダムに 4 つのグループに分けました。 - 1日あたり3回の間隔（各間隔15分）の放射線照射（NIR-PMC群）、10 mg/Kgの抗PD-1の静脈内注射（100μL、週2回）（抗PD-1群）、およびNIR-PMCおよび抗PD-1による共治療（共治療群）。 注目すべきことに、PMC、NIR-PMCおよび共治療群の動物は、7日目にPMCを腫瘍内注射しただけである。 マウスにおける PMC インプラントと免疫療法による乳がんの併用治療について、詳細な動物治療手順を図 5b に示します。 高酸素（300 mW/cm2 NIR、3 間隔）と 10 mg/Kg 抗 PD-1（100 μL、週 2 回）の併用指数（CI）は、報告されている式に従って計算されました。

ここで、AB、A、B はそれぞれ、NIR-PMC、抗 PD-1、および共治療における腫瘍体積です。 CI > 1 は拮抗作用を示し、CI = 1 は相加性を示し、CI < 1 は相乗作用を示します。 腫瘍は、IVISイメージングスペクトルシステム（PerkinElmer、メイン州、米国）およびCanonカメラ（日本）によって画像化されました。 マウスをペントバルビタールナトリウム（400 mg/kg）の過剰量で完全に麻酔し、屠殺し、腫瘍と肺を採取した。 組織サンプルは、サイトカインおよびアデノシン測定のために液体窒素中で保存するか、H&E 染色または A2AR、CD4、CD39、CD206、および CD73 発現の免疫染色のために固定しました。

腫瘍体積が約 50 mm3 の乳癌担持マウスを、25 μL の生理食塩水の腫瘍内注射 (溶媒制御)、60% 高圧酸素の 1 時間投与 (高圧 O2 グループ) など、以下の治療のためにサイコロを振ることによってランダムに 5 つのグループに分けました。 、25 μL 生理食塩水中の 3.6 × 104/mL PMC の腫瘍内注射 (PMC グループ)、毎日 300 mW/cm2 NIR 曝露と組み合わせた 25 μL 生理食塩水中の 3.6 × 104/mL の空のマイクロスフェアの腫瘍内注射 (NIR グループ)、および腫瘍内毎日 300 mW/cm2 NIR 曝露と組み合わせた 25 μL 生理食塩水中の 3.6 × 104/mL PMC の注射 (NIR-PMC グループ)。 各グループには３匹の動物が含まれた。 腫瘍内の酸素分圧 (pO2) は、メーカーのプロトコルに従って、pO2 モニター (POG-203、Unique Medical、東京、日本) のクラーク センサー (直径 0.4 mm) により 110 V でさまざまな深さで検出されました。

脾細胞の調製のために、BALB/c マウス (6 ～ 8 週齢、体重 20 g) を CO2 吸入により屠殺し、脾臓を採取しました。 脾臓を１０ｍＬの１６４０ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）中で粉砕した。 混合物を200メッシュナイロン膜(カタログ番号7061011、Dakewe、中国)で濾過して、組織破片を除去した。 懸濁液を500×gで5分間遠心分離し(Allegra 64 R、Beckman)、細胞ペレットを収集し、続いてPBSで2回洗浄した。 細胞ペレットを分散させ、５ｍＬの１×ＲＢＣ赤血球溶解緩衝液（８．２６ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ／Ｌ ＫＨＣＯ３および０．０３７ｇ／Ｌ ＥＤＴＡを含むＤＩ Ｈ２Ｏ）中で室温で５分間インキュベートした。 続いて、RPMI-1640 培地 (5 mL) を加えて溶解反応を停止し、遠心分離して脾細胞を収集しました。脾細胞は、後述するように T 細胞および NK 細胞の増殖に使用されました。

T 細胞の増殖のために、抗マウス CD28 および CD3 活性化抗体を CD3 で PBS に溶解し、6 ウェル プレート (1.5 mL/ウェル) に添加してウェル表面を 4 °C で 12 時間処理しました。 その後、各ウェル内の抗体溶液は廃棄され、コーティングされたプレートはマウス脾細胞からの T 細胞の増殖の準備が整いました。 上記のように調製した脾細胞を RPMI-1640 培地に 2 × 106/mL で再懸濁し、CD28/CD3 抗体でコーティングしたプレート (5 mL/ウェル) に加え、200 IU/mL の存在下で 48 時間インキュベートしました。 T 細胞の増殖には mL IL-2。 次に、事前に活性化した T 細胞を収集し、IFN-γ 産生のさらなる試験のために 24 ウェル プレート (2 × 106/mL、2 mL/ウェル) に移しました。

NK 細胞の増殖のために、脾細胞 (2 × 106/mL、5 mL/ウェル) を 20 ng/ml マウス IL-15 および 1000 IU/ml マウス IL-2 の存在下で 6 ウェル プレートに添加しました。 細胞培地を2日ごとに交換した。 7 日後、得られた細胞を 1 μL/1 × 106 細胞の抗 CD3-APC (カタログ番号 30041、Biolegend) および 1 μL/1 × 106 細胞の抗 NK1.1-PE (カタログ番号 557391、BD) で標識しました。バイオサイエンス）30分間。 染色された細胞を収集し、フローセルソーター（FACSMelody、BD）を使用してNK1.1 + CD3-NK細胞を選別した。 細胞溶解活性をさらに試験するために、選別された NK 細胞を 24 ウェル プレートに移しました。

ウサギ腫瘍 (20 ～ 30 mg) を 1 mL のトリゾールを含むスラリーパイプに加え、ホモジナイザー (PRO200、FLUKO、中国) で 2 分間腫瘍組織を解離させ、その後、氷上に 15 分間置いて細胞を溶解させました。 その後、4℃、6000×gで15分間遠心分離して上清を得ました。 次に、上清 0.5 mL にクロロホルム (0.2 mL) を加え、2 分間振動させて核酸を抽出しました。 氷上で 5 分間煮込んだ後、混合物を 4 °C、6000 × g で 15 分間遠心分離しました。 上部の水溶液 (0.2 mL) を収集し、新しい RNase フリーのエッペンドルフ チューブに移しました。 イソプロパノール (0.2 mL) を上清に加え、4 °C、6000 × g で 15 分間遠心分離しました。 ペレットを収集し、７５％エタノールで洗浄した。 得られたRNAを20μLのピロ炭酸ジエチル(DEPC)水に再溶解し、Nanodrop 2000c分光光度計(Thermo Fisher、USA)によりOD 260nmで濃度を定量した。 PCR 分析は、Anhui Leaobei Biotechnology Co. LTD (銅陵、中国) で、SYBR Green アッセイ キット (Thermo Fisher、米国) により、リアルタイム PCR システム (ABI-7300、米国) のもとで実施されました。 データは ABI Prism 7300 SDS ソフトウェアで分析され、2 つのグループ (n = 3) の各遺伝子の mRNA レベルが GAPDH の mRNA レベルに正規化されました。 使用したプライマーは補足表 2 にリストされています。

健康な BALB/c マウス (6 ～ 8 週齢、体重 20 g) をサイコロを振って無作為に 3 つのグループに分けました。 ０日目に、腹腔内または皮下注射によるＰＭＣ懸濁液（２５μＬ、３．６×１０４／ｍＬ）または等量のＰＢＳの投与のために動物を麻酔した。 動物は毎日 300 mW/cm2 の NIR 放射線にさらされました。 注射後、動物の行動と外観を定期的に検査した。 処置マウスを１、３および８日目にＣＯ２吸入により屠殺し、臓器（心臓、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓および皮膚）および血液を採取した。 臓器組織は、H&E または TUNEL 染色のために固定されました。 血液サンプル (各マウス約 400 μL) を、Mindray BC-2800Vet 血液分析装置 (Mindray Global、中国) による日常的な血液指標の検出に供しました。

すべての実験は少なくとも 3 回、3 ～ 10 回繰り返しました。 データは、少なくとも 3 回の反復からの平均 ± 標準偏差 (SD) として表されました。 すべての共焦点イメージングと免疫組織化学的染色イメージングを少なくとも 3 回繰り返しました。 データ分析は、SPSS 統計 17.0 ソフトウェアを介して両側スチューデント t 検定またはログ ランク検定によって実行されました。 p < 0.05の場合、差は統計的有意性とみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。 残りのデータは、記事、補足情報、またはソース データ ファイル内で入手できます。 イメージング データは、https://doi.org/10.5281/zenodo.6588765 に従って、パブリック リポジトリ Zenodo Dataverse に保管されます。ソース データは、このペーパーで提供されます。

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この研究は、中国国立自然科学財団 (RL へ 21976126)、江蘇省自然科学財団 (RL へ BK20211545)、中国国家重点研究開発プログラム、中国科学技術省 (2020YFA0710700) からの助成金によって支援されました。 RLに）。

これらの著者は同様に貢献しました: Weili Wang、Huizhen Zheng。

215123 中国、江蘇省蘇州市、蘇州大学、蘇州医科大学、江蘇高等教育機関の放射線医学共同イノベーションセンター、放射線医学および学際科学学校（RAD-X）、放射線医学および防護の国家主要研究所

Weili Wang、Huizheng Zheng、Jun Jiang、Hui Wang、Jie Jiang、Qianqian Xie、Meng Gao、Ruibin Li

蘇州大学第一附属病院インターベンショナル放射線科、蘇州大学、蘇州、江蘇省、215001、中国

志李

中国蘇州大学国立血液疾患臨床研究センター血液骨髄移植研究所

Dongpeng Jiang、Xiangru Shi、Jianhong Chu

蘇州大学蘇州医科大学公衆衛生学部、蘇州、江蘇省、215123、中国

蔡暁明

カリフォルニア大学カリフォルニアナノシステム研究所医学部ナノ医学部門、ロサンゼルス、カリフォルニア州、90095、米国

ティアン・シア

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RL がアイデアを思いつき、実験を計画しました。 WW はほとんどの実験を実行しました。 HZ と Ju.J. PMCを構築しました。 HZ は細胞増殖、HIF-1α、qPCR、新しい娘細胞のイメージング、およびアデノシン産生テストを実行しました。 ZL はウサギ腫瘍移植実験を実施しました。 ジュ・ジェイマウスの腫瘍移植実験を行った。 DJ、XS、JC は T 細胞と NK 細胞の抽出および活性試験に貢献しました。 HW と Ji.J. 腫瘍内の酸素レベルを検査しました。 XC、QX は、細胞および腫瘍内の HIF-1α レベルを定量化しました。 MGは細胞生存率試験に貢献しました。 TX は、高酸素微小環境における免疫療法のアイデアに貢献しました。 原稿の執筆は RL が主導し、WW の参加を得ました。

ルイビン・リーさんへの手紙。

著者は競合する利害関係を宣言していません

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Wang, W.、Zheng, H.、Jiang, J. 他高酸素微小環境を介して腫瘍の進行を遅らせるためのマイクロ酸素工場を設計します。 Nat Commun 13、4495 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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受信日: 2022 年 3 月 22 日

受理日: 2022 年 7 月 18 日

公開日: 2022 年 8 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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