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Nov 10, 2023

北極中部における亜硝酸塩の蓄積とアナモックス細菌のニッチ分割

Comunicazione ISME Volume 3,

ISME Communications volume 3、記事番号: 26 (2023) この記事を引用

902 アクセス

1 引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アナモックス細菌は、アンモニウムと亜硝酸塩を消費することにより、海洋堆積物を含む多くの環境における窒素循環において重要な機能的なギルドを形成します。 しかし、それらの分布と重要な基質亜硝酸塩への影響は十分に特徴づけられていません。 今回我々は生物地球化学的、微生物学的、ゲノム的アプローチを組み合わせて、北極海中央海嶺（AMOR）から採取した2つの堆積物コア中のアナモックス細菌とその他の窒素循環グループを研究した。 我々はこれらのコアに亜硝酸塩の蓄積を観察したが、この現象は他の28の海洋堆積物サイトや類似の水生環境でも記録されている。 亜硝酸塩の最大値は、アナモックス細菌の存在量の減少と一致します。 アナモックス細菌の存在量は、亜硝酸塩還元剤の存在量よりも少なくとも 1 桁高く、アナモックス存在量の最大値は亜硝酸塩最大値の上下の層で検出されました。 2 つの AMOR コアにおける亜硝酸塩の蓄積は、2 つのアナモックス細菌科 (Candidatus Bathyanammoxibiaceae と Candidatus Scalinduaceae) 間のニッチ分割と同時に発生し、おそらくアンモニウムの利用可能性に依存します。 優勢なアナモックスゲノム (Ca. Bathyanammoxibius amoris と Ca. Scalindua sediminis) の再構成と比較を通じて、Ca. Scalindua sediminis が存在することを明らかにしました。 B. amoris は、Ca よりも少ない高親和性アンモニウム トランスポーターを持っています。 S.セディミニスは、尿素やシアン酸塩などの代替基質および/またはエネルギー源にアクセスする能力を欠いています。 これらの特徴により、Ca が制限される可能性があります。 Bathyanammoxibiaceae より高いアンモニウム濃度の条件へ。 これらの発見は、亜硝酸塩の蓄積とアナモックス細菌のニッチ分配の同時発生を明らかにすることで、海洋堆積物における窒素循環についての理解を深めます。

生態系における窒素の循環は、微生物を介したプロセスのネットワークによって複雑に制御されています。 生態系では、新たに生物学的に利用可能な（または固定された）窒素がジアゾトロフィーによって生成され、脱窒と嫌気性アンモニウム酸化（anammox）という 2 つの窒素損失プロセスによって N2 に戻すことができます [たとえば [1] の総説を参照]。 後者の 2 つの嫌気性代謝は一般に、海洋の遠洋性酸素最小ゾーンまたは底生堆積物のいずれかの低酸素環境で有利に行われます [2]。 以前の推定では、底生生物における固定窒素の損失は、地球規模で水柱の 1.3 ～ 3 倍の大きさであることが示唆されています [3,4,5]。 したがって、堆積窒素損失プロセスは、海洋生息地全体の生物利用可能な窒素の量を制御する上で重要な役割を果たします。 亜硝酸塩はアナモックスと脱窒の両方の重要な基質であり [6, 7]、その利用可能性は窒素損失の大きさに大きな影響を与えます [8]。 しかし、亜硝酸塩が海洋堆積物中に硝酸塩やアンモニウムほど高いレベルまで蓄積することはほとんどないため、この広大な環境における亜硝酸塩の存在と変換経路はほとんど見落とされています。 アナモックス細菌は、アンモニウムを酸化するためにこの化合物を厳密に必要とするため、亜硝酸塩の主要な消費者の1つです。

20 年前に海洋環境で発見されて以来 [8]、アナモックスは固定窒素損失に大きく寄与していることが示されています [9]。 これまでに認識されていた海洋アナモックス細菌（Candidatus Brocadiaceae および Candidatus Scalinduaceae 科に属する）の中で、Ca. Scalinduaceae は海洋堆積物で一貫して検出されており [10、11、12、13]、いくつかの濃縮培養物が海岸堆積物から得られています [例: Ca. Scalindua japonica [14] と Ca. Scalindua profunda [15]]。 しかし、どこにでも存在しているように見えますが、Ca. Scalinduaceae は、海洋堆積物中に存在する唯一のアナモックス細菌科ではない可能性があります。 最近、北極海中央海嶺 (AMOR) の堆積物と地下水環境からメタゲノムで組み立てられたゲノムを調べることにより、アナモックス細菌の新しい科が発見されました (すなわち、Candidatus Bathyanammoxibiaceae [16])。 AMOR コアでは、両方の Ca. トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae は硝酸アンモニウム遷移帯と Ca 内に限定されています。 Bathyanammoxibiaceae の数は、対応する Ca を大幅に上回る場合があります。 カリンドゥア科 [16]。 AMOR 堆積物中に機能的に（ほぼ）同一の 2 つの系統が共存することにより、これらの系統が同じニッチを占めるのか、亜硝酸塩の分布と変化にどのような影響を与えるのかという疑問が生じました。

深海の堆積物にアナモックス細菌が蔓延していることを考えると、アナモックス細菌はアンモニウムの上向き拡散フラックスを消費し、堆積物からその上の海水へのアンモニウムの輸送を防ぐ上で重要な役割を果たすことが示唆されている[13]。 亜硝酸塩はアナモックスに必要な基質であるため[6]、同様に、アナモックスの存在量と代謝活性もアンモニウムに加えて亜硝酸塩の分布に強い影響を与える可能性があると仮説を立てています。 この仮説を検証するために、我々は生物地球化学的、微生物学的、およびゲノム的アプローチを組み合わせて、溶存窒素種の分布とアナモックス細菌および他の窒素循環グループとの関係を研究しました。 私たちは最初に、大陸斜面、中央海嶺、海溝などの多様な海洋堆積物系の硝酸塩枯渇帯における亜硝酸塩の蓄積現象を特定しました。 明らかな亜硝酸塩の蓄積を伴う 2 つの AMOR 堆積物コア内の微生物群集の高解像度分析を通じて、Ca ファミリー間のアナモックス細菌のニッチ分配を観察しました。 トカゲ科と Ca. 海洋堆積物に蔓延する Bathyanammoxibiaceae 。 新たに生成された高品質のアナモックスゲノムに基づいて、観察されたニッチ分割を駆動するおそらく根底にある遺伝的メカニズムも提案しました。

堆積物間隙水中の亜硝酸塩とアンモニウムおよび硝酸塩の測定は、北極海中央海嶺 (AMOR) 地域への航海中に海底から回収された十数個の堆積物コアに対して試みられました (例: [13, 17])。 。 ただし、一貫した亜硝酸塩プロファイル (検出可能な亜硝酸塩濃度を含む 2 つ以上の連続した深さとして定義) は、GS14-GC04 と GS16-GC04 の 2 つの炉心でのみ検出されました (以下の結果を参照)。 これら 2 つのコアは、酸素欠乏地帯の海水ではよく研究されているが、海洋堆積物ではよく研究されていない独特の地球化学現象である亜硝酸塩の蓄積の根底にあるメカニズムを調査する機会を提供しました。 コア GS16-GC04 の一般的な地球化学的背景 [13]、微生物学データ [13]、およびアナモックス細菌群集 [16] は以前に公開されているため、以下ではコア GS14-GC04 について完全な説明を提供します。

GS14-GC04 は、ホワイトスモーカー熱水噴出孔が報告されている北極中央海嶺にあるヤンマイエン熱水噴出孔場 (図 1A) の西 50 km にある深さ 1050 m の海山から採取された長さ 2.4 m のコアです [19] 、20]。 GS14-GC04の回収された堆積物中の全有機窒素含有量（図S1A）は0.06〜0.11％の範囲であると測定されましたが、全有機炭素含有量は0.5重量％未満と測定されました（図S2A）。 。 したがって、計算された炭素対窒素比（C / N）は、通常2〜4の範囲に収まりました（図S1B）。 酸素は回収されたコアの上部でわずか 15 μM であると測定され、海底から 23 cm 以内で枯渇しました。 酸素の枯渇深度より下では、溶存マンガンが間隙水に蓄積され（図S2B）、この現象はAMOR領域から回収された他の堆積物コアにも存在します[13]。 間隙水の pH は、他の AMOR コアと同様に 7.6 から 7.8 の間に下がりました [13]。 溶解したFeはコア全体では検出されず（図S1D）、回収された堆積物ではFeの還元が重要ではないことを示しています。 GS14-GC04は、GS16-GC04や他のAMORコアよりも高い濃度の溶存無機炭素（DIC）（図S2）を示し、重大な熱水影響はありません[13]。これは、GS14-GC04の有機物分解活性が高いことを示しています。 GS14-GC04 の最上部の堆積物はコアリング中に失われた可能性があるにもかかわらず（補足注 1 を参照）、このコアの酸素浸透深さは非熱水サイトよりも浅かった（たとえば、GS16-GC04 では約 110 cm（図 1C およびS2D)、および以前に [13] で説明されている他の 3 つのコアでは 35 ～ 100 cm)、深部の嫌気性微生物とその代謝の解釈に影響を与えません。

亜硝酸塩の蓄積が観察された北極海中央海嶺エリアの 2 つのコアリング サイト (この研究で調査された GS14-GC04 と参考文献 [13] で調査された GS16-GC04) を示す深浅地形図。 また、ヤン マイエン破砕帯とモーンス尾根、ヤン マイエン熱水噴出域 (黄色の星) も強調表示されています。 2 つの AMOR 堆積物コアにおける亜硝酸塩の蓄積。 (B) GS14-GC04 および (C) GS16-GC04 の硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウムの間隙水プロファイルを示します。 酸素ゾーンと 2 つの (上部および下部) 正味亜硝酸塩消費ゾーンが水平の帯で強調表示されています。 D 堆積物間隙水中に亜硝酸塩の蓄積が検出された堆積物の位置。 2つのAMORサイトは赤い円で示され、他のサイトは黄色の円で示されています（個々のサイトの間隙水の亜硝酸塩と硝酸塩のプロファイルについては図S3を参照）。 (A) と (D) のマップは、デフォルトのグローバル多重解像度地形合成ベースマップを使用して、GeoMapApp v. 3.6.14 (www.geomapapp.org) で生成されました。 (E) (D) に示す 30 の堆積物サイトの硝酸塩枯渇ゾーンにおける硝酸塩の流入と (上向きと下向きの合計) 亜硝酸塩の流出。 各サイトのペアのフラックスは黒い点線で接続されます。 F 個々のサイトの計算された亜硝酸塩/硝酸塩フラックス比。 水平線は 30 サイトの平均値を示し、破線は 95% 信頼区間を示します。

硝酸塩とアンモニウムの逆勾配が薄い硝酸アンモニウム遷移ゾーン内で収束する GS16-GC04 (図 1C) や [13] で以前に説明された他の AMOR コアとは対照的に、コア GS14-GC04 は、硝酸塩の下向きフラックスとアンモニウムの上向きフラックス。 GS14-GC04 の硝酸塩は深さとともに減少し、130 cm 付近で枯渇しました (図 1B)。 しかし、この炉心のアンモニウムは、硝酸塩の枯渇深度よりもはるかに低い213 cmまで間隙水中に検出されませんでした（図1B）。

亜硝酸塩が日常的に測定されているが、一般に測定されたすべての深さにわたって検出されないほとんどの AMOR 堆積物コアとは異なり [17]、GS14-GC04 の亜硝酸塩は硝酸塩枯渇ゾーン (50 ～ 180 cm) の周囲に蓄積し、濃度最大値 (約 3 μM) は105cm（図1B）。 GS16-GC04 の硝酸塩枯渇ゾーンでも、規模が低く (約 1 μM)、垂直スパンが短い (150 ～ 200 cm) にもかかわらず、同様の亜硝酸塩の蓄積が検出されました (図 1C)。 出版された文献を検索したところ、硝酸塩枯渇帯の周囲にこのような亜硝酸塩の蓄積が、さらに28の地球規模に分布する堆積物コアで見られることがわかりました（図1D。補足図の個々のコアの亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニウムの詳細なプロファイルを参照してください）。 S3)。 このような蓄積は主に、大陸斜面の堆積物 [例 [21,22,23,24]]、太平洋と大西洋の中央海嶺 [25] 沿い、太平洋の海溝内 [10] で検出されました。 、２６、２７］、大陸縁辺や深海平原ではなく。 これらのサイトのほとんどは、アナモックス反応が起こる硝酸アンモニウム遷移ゾーン（図S3）内に亜硝酸塩を蓄積します[13]。 この配列は、アナモックス細菌と観察された亜硝酸塩の蓄積との間の潜在的な関連性を示唆しています。 亜硝酸塩の蓄積は堆積物の上部数メートルではほとんど検出されなかった。(i) 大陸縁辺では硝酸塩の浸透が浅すぎて専用のマイクロスケール測定なしでは適切に分解できないため、また、(ii) 深海平原 [例 [26]] では間隙水が多いため硝酸塩と O2 の濃度は堆積物の深部に存在します [26、28、29、30]。 この比較を通じて、大陸斜面、中央海嶺、および海溝の堆積物中に観察された亜硝酸塩の蓄積は、硝酸塩枯渇帯内の低濃度の硝酸塩と密接に関連している可能性が高く、これは中程度のレベルの硝酸塩によって引き起こされます。有機物のフラックス。 私たちのまとめは、亜硝酸塩の蓄積が中間有機炭素雨の堆積物サイトに世界中に分布していることを示唆していますが、海洋堆積物系における亜硝酸塩の蓄積の頻度と機構的制御を評価するには、より体系的なサンプリングが必要です。

海洋堆積物では一般に報告されていないが、硝酸塩濃度の低下と同時に起こる亜硝酸塩の蓄積は、黒海 [31, 32] やゴルフォ ドゥルセ [33] の水柱、淡水のタンガニーカ湖 [34] などの他の層状の水生環境ではよく観察される。 、南極のマクマードドライバレーの超塩分濃度の高いバンダ湖とボニー湖[35]、川と河口の堆積物[36、37]、亜熱帯のマングローブの堆積物[38]、下水処理施設の脱窒バイオフィルム[39]。 この観察は、低硝酸塩ゾーン内での亜硝酸塩の蓄積が、酸化還元勾配を抱える多様な水生環境で起こることを示しています。

30の堆積物コア（つまり、2つのAMORサイトと28の参照サイト）の亜硝酸塩濃度の最大値は一般に3μM未満であり（図S3）、太平洋の[23]のステーション13で最大8μMの亜硝酸塩が検出されました。 (図 1D の部位 #15)。 これらの亜硝酸塩濃度は、酸素欠乏地帯で測定されたものと同等かそれよりも高い [例: [40, 41]]。 30 のコアでは、亜硝酸塩濃度は付随する硝酸塩濃度よりも一般的に低く、亜硝酸塩が堆積物中の微量な無機窒素種にすぎないことを示しています。 しかし、亜硝酸塩は多くの微生物にとって中心的な代謝物であり、濃度が低いということは、亜硝酸塩が重要ではない代謝物ではなく、その速い代謝回転が環境とよく結びついていることを示唆しているだけである[42]。

2 つの AMOR コアでは、亜硝酸塩蓄積ゾーンはその上にある酸素ゾーンから十分に分離されており (図 1B、C)、好気性プロセス (アンモニアや亜硝酸塩の酸化など) が生成に寄与したとしても、実質的に寄与していない可能性があることを示しています。または蓄積された亜硝酸塩の消費。 むしろ、亜硝酸塩の蓄積は、亜硝酸塩生成の嫌気性プロセス（例えば、異化性硝酸塩還元）と亜硝酸塩消費（例えば、亜硝酸塩還元とアナモックス）の間の不均衡から生じる可能性が高い。

硝酸塩枯渇ゾーンにおける亜硝酸塩の蓄積は、検出された亜硝酸塩の一部が上方と下方の両方に拡散し、亜硝酸塩の消費が激化する 2 つの異なるゾーン（たとえば、硝酸塩枯渇深度の上下）をサポートしている可能性があることも示しています。 図 1D に示す合計 30 の堆積物サイトの硝酸塩枯渇ゾーンからの硝酸塩の流入と亜硝酸塩の合計 (上向きと下向きの合計) の流出を計算することにより、1 つのサイト (サイト #14) を除くすべてのサイトで、 、Pacific Station 12 は [23] で報告しています) 硝酸塩フラックスは、すべてのサイトで合計された亜硝酸塩フラックスよりも高いです (図 1E)。 このため、1 つのサイトを除くすべてのサイトで計算された硝酸塩と亜硝酸塩のフラックスの比は 0.6 未満であり (図 1F)、平均比は 0.285 ± 0.07 (平均 ± 95% 信頼区間) でした。 この計算は、(i) 亜硝酸塩のフラックスは、硝酸塩枯渇ゾーン内で消費される硝酸塩のフラックスの 4 分の 1 程度しか占めておらず、(ii) そのゾーンに拡散する硝酸塩の大部分は、測定されていないさらなる減少によって失われることを示唆しています。ガス状化合物 (例: N2)。

どの微生物グループが観察された亜硝酸塩の蓄積の制御に役割を果たしているかを解明するために、GS14-GC04の13の堆積物層に対して16 S rRNA遺伝子アンプリコンの配列決定を実行しましたが、GS16-GC04の同様のデータは以前に[13]によって生成されています。 我々は、GS14-GC04 のほとんどの層に推定上のアナモックス細菌 (Ca. Scalinduaceae と Ca. Bathyanammoxibiaceae の両科に属する [16]) が蔓延していることに注目しました。 成長が遅いことで有名なアナモックス細菌 [43] は、このコアの群集に大きく貢献しており、酸素ゾーンの最上部の堆積物で群集全体の 6% を占め、最初のピークでは群集全体の 11% まで増加しました。上部亜硝酸塩消費ゾーン（図 2A）。 75〜120cmの間隔で大規模な崩壊が発生した後、アナモックスの相対存在量は再び増加し、第2亜硝酸塩消費ゾーン内のコミュニティ全体の約18％の第2ピークに達し、その後、より深い堆積物で再び減少しました（図1）。 2A）。 比較すると、他の星系のアナモックス群集は、ハダル堆積物では総人口の 5% 未満 [10]、アラビア海の ODZ では 2% 未満を占めています [44]。 2 番目のピークは、ほぼ広い硝酸アンモニウム遷移ゾーン内にありました。 対照的に、GS16-GC04のアナモックス細菌は主に硝酸アンモニウム移行ゾーン（約120〜190 cm）内で検出されましたが（コミュニティの最大18％）、酸素ゾーンでは検出されませんでした（図2J）。 それでも、GS14-GC04と同様に、この2番目のコアは、亜硝酸塩最大値に隣接する上部および下部の正味亜硝酸塩消費ゾーンで観察される2つの相対存在量ピークを示します（図2J）。

GS14-GC04 (A ～ I) と GS16-GC04 (J ～ R) の両方のコアからのデータが表示されます。 (A-D) および (J-M) のデータは、16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定によって評価された官能基の相対存在量です。 (EI) および (NR) では、黒丸は、診断遺伝子を標的とする特定のプライマーを使用した qPCR によって決定されたこれらのグループの絶対存在量を示し、白丸は、生成物として計算されたアナモックス細菌、AOA、AOB、および NOB の絶対存在量を示します。総細胞数（図S4Aに示す）とコミュニティ全体におけるそれぞれの相対存在量。 ゾーンは、図 1B、C に示されている定義に従って強調表示されていますが、亜硝酸塩プロファイルも (A) と (J) に再プロットされており、各炉心の 2 つの正味亜硝酸塩消費ゾーンを示すのに役立ちます。 コア GS16-GC04 のパネル (J、N、R) は、参考文献で公開されているデータから派生しています。 [16]。

アナモックス細菌の相対存在量の変化が他の分類群の成長/衰退とアナモックス自体の成長/崩壊によって引き起こされるかどうかを確認するために、2 つの相補的な方法を使用して 2 つの AMOR コアにおけるアナモックス細菌の絶対存在量を追跡しました。アナモックス代謝の最終段階であり、したがってアナモックス細菌の診断遺伝子であるヒドラジンデヒドロゲナーゼをコードする機能遺伝子 hzo、および (ii) 総細胞存在量の積として計算 (次のように 16 S rRNA 遺伝子の合計として推定)コアGS14-GC04については図S4Aに示されています）、および16 S rRNA遺伝子アンプリコンの配列決定によって得られた相対存在量。 他の AMOR コア [13] で示されているように、2 つの方法の結果は 2 つのコアで一般に互いに一致しており (図 2E、N)、主要なアナモックスクレードがこの分析で考慮されていることを示しています。 GS14-GC04 の上部および下部におけるアナモックス細菌の蔓延は、湿った堆積物あたり 106 ～ 108 細胞 g-1 の範囲で絶対存在量が高いことによって裏付けられましたが、検出される存在量は比較的低い 102 ～ 104 細胞 g-1 でした。コアの中央部分（75〜120 cm bsf）（図3E）。 対照的に、GS16-GC04 のアナモックス細菌は、[13] に記載されている他の 3 つの AMOR コアと同様に、硝酸アンモニウム遷移ゾーン内に限定されていました (図 2N)。 したがって、GS14-GC04 からの我々の結果は、アナモックス細菌がこれまで示唆されていたよりも硝酸アンモニウムゾーンから離れた海洋堆積物中で繁殖できることを示唆しています。

調査された堆積物層における 8 つのアナモックス OTU の出現と相対存在量を示す AA ヒートマップ。 ヒートマップの下部に示されている個々の OTU の分類学的分類は、(B) の系統学的配置に基づいています。 B アナモックス細菌の最尤系統樹。 GS14-GC04 から回収されたアナモックス細菌 OTU (97% 同一性カットオフ) は赤色で強調表示されます。 AMOR 堆積物から回収された 2 つのゲノムは青色で強調表示されています。 バーは、残基ごとの推定配列相違を示します。 ツリーの堅牢性は 1,000 回の超高速ブートストラップ反復によって評価され、70 を超えるブートストラップ値は凡例に示された記号で示されています。

アナモックス細菌 (主に Ca. Scalinduaceae に属する) も、GS14-GC04 の酸素ゾーン (図 2E、最大 20 μM O2) で検出されました。 酸素存在下でのアナモックス細菌のそのような存在は、GS16-GC04 (図 2N)、以前に報告された他の AMOR コア [13]、またはハダル トレンチ コア [10] では検出されませんでした。 初期のバイオリアクター研究では、1 μM O2 がアナモックス代謝を可逆的に阻害することが示されていますが [45]、最大 25 μM O2 の酸素を含んだ海水ではアナモックス細菌とその活性が検出されています [46, 47]。これは粒子と会合することで促進される可能性があります [46, 47]。 48] およびその中の微環境 [49] 特に高有機炭素環境。 粒子とコロニー形成された表面は海洋堆積物中に広く分布しており、バルク酸素化環境であっても無酸素ミクロニッチを抱えて無酸素生息地を大幅に拡大する可能性がある[50、51]。 したがって、一般に典型的な堆積物よりも粒径が大きい熱水堆積物における無酸素微小環境の増加により、バルクの酸素表面堆積物中にアナモックス細菌が存在する可能性がある。 あるいは、酸素ゾーンで検出されたアナモックス細菌は休眠している可能性があります。 それにもかかわらず、地表堆積物中のアナモックス細菌の検出は、地下の硝酸アンモニウム移行帯で繁殖するアナモックス細菌が地表堆積物から播種されたという以前の仮説を裏付けています[13]。

アンモニウムは、大陸棚や斜面のほとんどの無酸素堆積物間隙水に存在する主要な固定窒素種です。 これらの堆積物では、アンモニウムは主に有機窒素の分解とアンモニウムへの異化性硝酸塩還元（DNRA）によって生成され、好気性アンモニア酸化やアナモックスなどの生物学的代謝活動や生物学的再同化によって消費される可能性がありますが、後者は最小限である必要があります。微生物の代謝回転速度が非常に遅いためです。 これまでの研究では、アンモニア酸化古細菌 (AOA) が酸素ゾーン [29, 53] に、アナモックス細菌が硝酸アンモニウム遷移ゾーン [13] に蔓延しており、これらが主要ニッチにおける主要なアンモニア消費者である可能性があることが示されています。 GS14-GC04では、深さとともにDIC濃度が増加することから明らかなように、有機物の分解によるアンモニウムの継続的な放出（図S2）にもかかわらず、硝酸塩と亜硝酸塩の両方が間隙水から枯渇するまでアンモニウムは検出されませんでした（図1B）。上部 180 cm 堆積物全体のアンモニア消費量。 しかし、堆積物の酸素欠乏と硝酸塩欠乏の深さの間、つまりAOAとアナモックス細菌の主要なニッチの間で、どの微生物がアンモニア消費を支配しているのかはまだ不明である。

アンモニア消費に対するアナモックス細菌の相対的な重要性をより深く理解するために、アナモックス細菌自体に加えて、2 つの AMOR コアにおける AOA とアンモニア酸化細菌 (AOB) の分布 (つまり、相対存在量と絶対存在量の両方) を調べました。上記の 2 つの微生物定量法を使用します。 酸素の必要量 [54, 55] と一致して、AOA (ニトロソプミラ綱 [56, 57] に属する) と AOB はどちらも主に酸素ゾーン (すなわち、GS14-GC04 の上部 10 cm の堆積物) で検出されました (図 1)。 16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定による (図 2B、C) および GS16-GC04 の上部 110 cm (図 2K、L))。 一方、相対存在量が低い AOB [GS14-GC04 全体のコミュニティ全体の <0.3% (図 2C)、および GS16-GC04 全体の <1.5% (図 2L)] は酸素ゾーンに限定されているようです (図 2G、 P)、AOA は有酸素帯だけでなく、より深い無酸素堆積物でも検出されました (図 2F、O)。 2 つの方法で測定された AOA 存在量の不一致 (図 2F) は、AOA amoA 遺伝子アッセイの qPCR プライマーが一部の新規 AOA 遺伝子型を検出できず、そのため AOA 存在量が過小評価されている可能性があると考えられます。 AOA は酸素の不在下でアンモニウムを亜硝酸塩に酸化する可能性があるが [58]、酸素欠乏の深さと硝酸塩欠乏の深さの間の堆積物における AOA の存在量は、アナモックス細菌の存在量より少なくとも 1 桁低かった。そのため、アナモックス細菌が酸素欠乏深度全体でアンモニア消費者を支配している可能性が高くなります。 したがって、硝酸アンモニウム遷移帯[13]に加えて、GS14-GC04の酸素欠乏と硝酸欠乏の深さの間の堆積物中の有機物の分解から遊離したアンモニウムも、主にアナモックス細菌によって異化基質として消費される可能性がある。そして、すべての微生物がその同化性窒素源として利用します。

異化的硝酸塩還元は両方のAMORコアの酸素欠乏性堆積物における亜硝酸塩生成のプロセスである可能性が高いという我々の推測を裏付けるために、膜結合型硝酸還元酵素αサブユニットをコードするnarG遺伝子を標的としたqPCRによって硝酸塩還元細菌の存在量を検出し、定量した。 コア全体で narG が検出され、一般にダウンコアの減少傾向が示されました。 特に、最上部の堆積物では最大 106 コピー g-1 の narG が検出され、2 つの AMOR コアの亜硝酸塩蓄積ゾーン内では ~104 コピー g-1 の narG が検出されました (図 2I、R)。この経路を利用して硝酸塩を還元し、蓄積した亜硝酸塩を生成します。

亜硝酸塩消費に対するアナモックス細菌の寄与を評価するために、亜硝酸塩消費に関与する他の 2 つの官能基である亜硝酸酸化細菌と亜硝酸還元細菌の同時分布も定量化しました。 GS14-GC04 と GS16-GC04 の両方において、細菌属 Nitrospira および Nitrospina に属する NOB の相対存在量は、浅い堆積物では深さとともに増加し、その後低レベル (群集全体の 0.5% 未満) に減少することが観察されました。酸素が検出できない堆積物 (図 2D、M)。 酸素欠乏の堆積物中に推定上の NOB が存在することは、計算された絶対存在量によっても裏付けられます (図 2H、Q)。 これらの観察は、一部の NOB が酸素欠乏の堆積物中に長期間残留する可能性があることを示唆しています。 ニトロスピラおよびニトロスピナ NOB は代謝的に多用途であるが [59] で概説されているように、酸素なしで亜硝酸塩酸化活性を維持することは知られていないため、酸素欠乏性堆積物中の亜硝酸塩の分布に大きな影響を与えることはないはずである。 さらに、nirS および nirK 遺伝子の絶対存在量で示される亜硝酸塩還元細菌の存在量は、アナモックス細菌の存在量よりも少なくとも 1 桁低かった (図 2I、R)。 両方のコアの亜硝酸塩蓄積ゾーンでは、亜硝酸塩還元細菌集団は nirS 含有メンバーによって支配されていました (図 2I、R)。 隣接する層と比較して、両方のコアの亜硝酸塩蓄積ゾーンには、nirS の存在量が少ないのではなく、むしろ多量に存在していました（図 2I、R）。これは、亜硝酸塩の蓄積が亜硝酸塩還元剤の存在量の減少に起因しないことを示しています。 ただし、遺伝子存在量の変動は必ずしも代謝速度の違いを表すわけではないため、AMOR 堆積物中の亜硝酸塩の分布に対する亜硝酸塩還元剤の影響を確実に評価するには、さまざまな深さでの亜硝酸塩の減少速度の将来の測定が必要です。 それにもかかわらず、存在量の議論だけを見ても、アナモックス細菌は極めて重要であり、亜硝酸塩蓄積の深さでは、他の異化性アンモニウムおよび亜硝酸塩消費者の数を少なくとも一桁上回っています。

GS14-GC04 におけるアナモックス細菌の 2 つの相対存在量ピークにつながる理由を解明するために、個々の OTU (97% ヌクレオチド同一性カットオフ) のレベルでアナモックス細菌群集を調べました。 アナモックス細菌は、8 つの OTU (OTU_2、OTU_6、OTU_180、OTU_571、OTU_595、OTU_602、OTU_4527、および OTU_4769) で表されました (図 3A)。 これらのアナモックス系統型のうち、OTU_2 のみが堆積物コア全体で検出され、他の OTU は離散的な堆積物層でのみ検出されました (図 3A)。 系統解析 (図 3B) により、OTU_2、OTU_571、OTU_602、OTU_4527、および OTU_4769 が Ca のメンバーであることが示されました。 OTU_2 が Ca と一致する Scalinduaceae 科。 Scalindua sediminis は、AMOR 堆積物に蔓延していることが以前に証明されているアナモックス細菌です [13]。 OTU_602 と OTU_4769 は、Ca を含む幅広いクラスターに分類されました。 S. brodae [60]、Ca。 S. profunda [15]、および Ca. S. japonica [14]、沿岸堆積物からの 3 つのアナモックス濃縮培養物。 他の 3 つの OTU (OTU_6、OTU_180、および OTU_595) は、新しく提案されたアナモックス細菌ファミリー Ca のメンバーです。 Bathyanammoxibiaceae [16]、AMOR 地域 [13] および南シナ海などの他の場所からの未培養アナモックス細菌のクラスター [61] (図 3B)。 GS16-GC04 におけるアナモックス細菌の正体と分布の分析は以前に他の場所で記載されています [16]。 トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae も見つかりました。

2 つのファミリーのアナモックス細菌は、両方の AMOR コアで顕著に対照的な分布パターンを示します。 GS14-GC04では、Ca。 Scalinduaceae は最も浅い堆積物で群集全体の 7% を占め、深さとともに減少し、120 ～ 220 cm の間隔で再び増加し、160 cm でピーク (群集全体の 18%) が検出されました (図 4A)。 Ca. Bathyanammoxibiaceae は逆の傾向を示しました。 このファミリーは、調査した最上部の 2 つの堆積物層では検出されませんでしたが、上部の堆積物で増加して 50 cm のピーク（コミュニティ全体の 11%）に達し、その後、より深い層では低レベルに減少しました（図 4A）。 GS16-GC04では、Ca。 Scalinduaceae は 125 ～ 170 cm の間隔 (つまり、硝酸アンモニウム遷移帯の上部) を占め、Ca は 125 ～ 170 cm の間隔を占めていました。 Bathyanammoxibiaceae は 170 ～ 220 cm の範囲 (つまり、硝酸アンモニウム遷移帯の下部) に閉じ込められていました (図 4C)。 GS16-GC04で観察されたアナモックス細菌ファミリーのこのような分布は、[13]で以前に記載された別のAMORコアであるGS16-GC05（図S5）でも見られ、50〜60 cmの間隔で亜硝酸塩の存在の弱いシグナルが見られました。機内測定では注目されましたが、定量化されていませんでした。 AMOR コアでのこれらの観察は、海洋環境における 2 つのアナモックス細菌ファミリー間のニッチ分配 (優勢なファミリー間の取引) の最初の証拠を提供します。

16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定によって評価した、コア GS14-GC04 (A) および GS16-GC04 (C) 全体にわたるアナモックス ファミリー (Ca. Scalinduaceae および Ca. Bathyanammoxibiaceae) の相対存在量。 コア GS14-GC04 (B) および GS16-GC04 (D) における 2 つのアナモックス ファミリーの絶対存在量。総細胞数とコミュニティ全体における相対存在量の積として計算されます。 パネル (C、D) は参考文献から再プロットされています。 [16]。

2 つのアナモックス細菌ファミリーを区別することは、亜硝酸塩消費におけるそれぞれの役割をより適切に評価するのに役立ちます。 Caの絶対存在量を計算することによって。 トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae では、その絶対存在量のピークが、GS14-GC04 (図 4B) および GS16-GC04 (図 4D) の亜硝酸塩濃度最大値の上下にある 2 つの正味亜硝酸塩消費ゾーンとよく一致していることは明らかであり、これらが存在する可能性が高いことを示しています。地域の亜硝酸塩消費に大きく貢献しています。 他の 2 つの AMOR コア (GS14-GC08 および GS14-GC09) では、亜硝酸塩の蓄積は検出されず [13]、Ca 間に明確なニッチ分配はありません。 トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae が観察できる [16]。 少数の AMOR コアのこの比較は、AMOR 堆積物における亜硝酸塩の蓄積と 2 つのアナモックス細菌ファミリー間のニッチ分配との同時発生を示唆しています。 アナモックスの存在量が少ない酸素欠乏深度は亜硝酸塩の蓄積と一致しており、2 つのファミリーのピークの間に挟まれていますが、2 つのアナモックス細菌ファミリーのニッチ分離につながる完全な動態は、さらなる研究によってまだ解明されていません。

2 つのアナモックス細菌ファミリーの分布に関しては、GS14-GC04 と他の 2 つのコア (GS16-GC04 および GS16-GC05) の間には逆の傾向が存在するようです。 Bathyanammoxibiaceae は、GS14-GC04 の上部の亜硝酸塩消費ゾーンを占めていましたが、GS16-GC04 および GS16-GC05 の下部は占めていました (図 4B、D、および S5)。 ただし、これらのコア間の不一致は、GS14-GC04 のコアリングが不十分であることが原因である可能性があります。 相対存在量プロファイル (図 4A) には容易に反映されませんが、Ca。 GS14-GC04 の Bathyanammoxibiaceae は、より深い堆積物に向かう深さ (亜硝酸塩消費量の低いゾーンを含む) に応じて絶対存在量の増加を示しました (図 4B)。 Ca の発生のみが原因で、より深い堆積物におけるその優勢性は十分に解決されなかった可能性があります。 アンモニウムを含む深層堆積物中の Bathyanammoxibiaceae が捕獲されました (図 4B)。 したがって、ここで検討した AMOR コアには Ca が含まれていると推測されます。 Bathyanammoxibiaceae は、アンモニウムの利用可能性と Ca がより高い条件を好む可能性があります。 Scalinduaceae はアンモニア条件が低い。

地下堆積物中の微生物の活動が低いと、世代時間が長くなり、個体群の進化プロセスが長引く可能性があります。 GS14-GC04 および GS16-GC04 で観察された 2 つのアナモックス細菌ファミリーの存在量の最大値は、それぞれ約 110 cm および 45 cm の沈降によって分離されました (図 4)。 この領域での堆積速度が約 2 cm ky−1 であることを考慮すると [62]、2 つの AMOR コアにおける 2 つのアナモックスファミリー間のニッチ分割の最大持続期間は約 55,000 年と推定できます。 この長期にわたるニッチ分割プロセス中に観察されたGS14-GC04のアナモックス細菌集団全体の部分的な崩壊（図2E）は、アナモックス細菌の2つの必須基質である亜硝酸塩とアンモニウムの変化によって引き起こされる可能性があります。 しかし、次の 2 つの観察は、亜硝酸塩蓄積ゾーンにおける亜硝酸塩のわずかな増加がアナモックス細菌の活動や存在量に強い影響を与える可能性があるというシナリオに反しています。 まず、アナモックス細菌の存在量が亜硝酸塩の低い深さでは高く、亜硝酸塩の深い深さでは低かったという観察（図2A、E）を考慮すると、測定された亜硝酸塩濃度が検出されたアナモックス細菌の燃料となるには低すぎる可能性は低いです。 第二に、GS14-GC04 で測定された最高亜硝酸塩濃度 (3.3 μM) は、報告されているアナモックス細菌による許容亜硝酸塩の mM レベルよりもはるかに低いです (例、Ca. S. japonica では 7.5 mM [63]、Ca. Kuenenia では 2.1 mM) stuttgartiensis [64]、下水汚泥から濃縮されたアナモックス細菌の場合は 6 mM [65]）、局所的な亜硝酸塩濃度がアナモックス細菌を阻害しないはずであることを示しています。 むしろ、アンモニウム供給の減少が、アナモックス細菌集団の部分的な崩壊の原因である可能性のある要因です。 硝酸塩枯渇ゾーンと比較して、より浅い堆積物は有機物の分解速度が高いため、より多くのアンモニウム供給を受ける可能性がありますが、より深い堆積物はより深い無酸素堆積物からのアンモニウムの上向き拡散によりより多くのアンモニウム供給を受ける可能性があります。 亜硝酸塩蓄積ゾーンにおけるアンモニウム供給量の低下により、GS14-GC04 のアナモックス個体数が制限され、その結果亜硝酸塩の蓄積が持続した可能性があります。 GS16-GC04 と比較して、GS14-GC04 は亜硝酸塩の蓄積量が大きく (図 1C)、アナモックスファミリー間の垂直方向の分割が大きい (図 4)、およびアナモックス個体群の明らかな崩壊 (図 2N) を特徴としています。これは、硝酸塩とアンモニウムの間の分離が拡大したことに起因します (図 1B)。 GS14-GC04 とは異なり、GS16-GC04 の深い堆積物から拡散するアンモニウムは、亜硝酸塩消費量の低いゾーン内で消費されるだけでなく、亜硝​​酸塩蓄積ゾーン（図 1C）に入り、そこに生息するアナモックス細菌をサポートする可能性があります。 言い換えれば、2 つの異なるアンモニウム源が中央でアナモックスをサポートできないほど離れている場合、亜硝酸塩が蓄積する可能性があり、GS16-GC04 よりも GS14-GC04 の方が深刻な影響を及ぼします。 硝酸塩とアンモニウムの間の垂直分離に依存しているため、GS14-GC04 と GS16-GC04 で観察されるように、これら 2 つの栄養素がさらに分割されるほど、より多くの亜硝酸塩が蓄積するはずです。

遠洋性海洋堆積物からのアナモックス培養物が欠如していることを考慮して、AMOR堆積物における2つのアナモックス細菌ファミリー間のニッチ分割につながる潜在的な（そしておそらく考えられる）理由を特定するために、比較ゲノム分析に依存しました。 このような分析には高品質のゲノムが必須条件です。 Caですが。 Scalindua sediminis [13] は、Ca の高品質な代表です。 Scalinduaceae ファミリー、Ca の以前のメタゲノム構築ゲノム (MAG)。 AMOR 堆積物 Bin_158 の Bathyanammoxibiaceae は、74% しか完成していないと推定されました [16]。 したがって、高品質の Ca の代表的なゲノムを取得します。 AMOR 堆積物中の Bathyanammoxibiaceae について、堆積物地平 GC05_55cm でメタゲノム配列決定を行った。 この堆積物層の Bathyanammoxibiaceae は、16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定によって原核生物群集全体の 28% を占めることが明らかになりました [16]。 メタゲノムアセンブリとビニングにより、Ca に関連付けられた高品質の MAG (完全性 96.6%、冗長性 1.5%) が得られました。 バティヤナンモキシビア科。 この MAG のコンティグは、共起する Ca よりも高いグアニン-シトシン (GC) 含有量を示します。 Scalindua sediminis (図 5A および S6)、したがって確実に区別できます。 このＭＡＧは、サイズが２．１メガ塩基対であり、他の科のアナモックス細菌よりも小さく（図５Ａ）、１９０５個のコーディング遺伝子が３２個の足場上に分布している。 これは、以前にコア GS14-GC08 から回収された Bin_158 と 98% の平均ヌクレオチド同一性を有しており [16]、したがって AMOR 堆積物中に蔓延していることが示されている同じアナモックス細菌種とみなすことができます。 これはリボソーム オペロンを有しており、16 S rRNA 遺伝子 (1 334 bp) は、ここで示した GS14-GC04 の OTU_6 (図 3B) および以前に特徴付けられた 4 つの AMOR コア [16] の OTU_23 と 100% 一致します。それは、これらの AMOR コアにおいて最も優勢な Bathyanammoxibius 系統型を表す可能性があるということです。 また、ヒドラジン シンターゼ (ただし、アルファ、ベータ、ガンマ サブユニットは 2 つの別々のコンティグの末端に位置します)、ヒドラジン デヒドロゲナーゼ、亜硝酸酸化還元酵素など、コア アナモックス代謝に必要なすべての遺伝子も含まれています。 我々は暫定的にこの MAG を Candidatus Bathyanammoxibius amoris (この MAG の起源の場所である AMOR にちなんで命名) と名付けます。

アナモックス細菌ゲノムの 3 つのファミリーの GC 含量に対するゲノム サイズの AA プロット。 Ca. Bathyanammoxibius amoris (この研究における) および Ca. Scalindua sediminis (参考文献 [13])、Ca 科の代表。 Bathyanammoxibiaceae および Ca. 海洋堆積物に広く分布する Scalinduaceae が強調表示されています。 B Ca 間の共有および固有の遺伝子クラスターを示すベン図。 B.アモリスおよびCa. S.セディミニス。

Caを使用して。 S.セディミニスおよびCa. Caの代表的なゲノムとしてのB. amoris。 トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae 科はそれぞれ、このシステムで優勢であることが示されたため、AMOR 堆積物中の 2 つのアナモックス細菌科間のニッチ分割につながる可能性のある潜在的な理由を特定するために比較ゲノム分析を実行しました。 2 つのゲノムを合わせたものには、1548 個の遺伝子クラスターにまとめられた 4808 個の遺伝子が含まれており、そのうち 917 個が 2 つのゲノムに共有されています (図 5B)。 残りの 631 個の遺伝子クラスターのうち、457 個は Ca に固有です。 S. sediminis および他の 174 個の遺伝子クラスターは、Ca に特有です。 B.アモリス(図5B)。 どちらもアナモックスゲノムであるため、コアアナモックス代謝の主要な酵素をコードする遺伝子は、共有遺伝子クラスターの中に含まれます（補足データセット S2 に含まれます）。 Caと比べて。 Scalindua sediminis [13]、Ca。 B. amoris にはウレアーゼとシアナーゼが欠如しており (図 5B)、エネルギーを節約したり、尿素やシアネートの分解により余分なアンモニウムを生成したりする能力がないことを示しています。 海洋堆積物中のシアン酸塩の利用可能性は決定されていませんが、尿素濃度はアンモニウムの 8 分の 1 であることが測定されています [66、67]。 無酸素堆積物における尿素生成の大部分は、プリンとピリミジンの微生物分解[68]によるものである[69]が、酸素堆積物中には大型動物が存在する場合、尿素生成にも役割を果たしている可能性がある[70]。 尿素加水分解能力により Ca が得られる可能性があります。 S. sedimini は、表面の酸素性堆積物など、アンモニアが制限された環境で生息することが競争上の利点です (図 4A、B)。 Ca. B. amoris には、Ca に存在する酵素であるチオ硫酸レダクターゼも欠如しています。 S. sediminis および他のいくつかのアナモックス細菌 [71] により、電子受容体としてチオ硫酸塩を利用できる可能性があります。 Caに存在するユニークな遺伝子。 B. amoris には、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸:フェロドキシン酸化還元酵素、および [NiFe] ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が含まれており (図 5B)、これらはすべて発酵に関与している可能性があります。

観察されたアンモニウム濃度がアナモックス細菌の 2 つのニッチ間で大きく異なることを考慮して、入手可能な高品質のアナモックス細菌におけるアンモニウム輸送体 (Amt) (生命のあらゆる領域で保存されているアンモニウム同化に必須の細胞装置) の種類と数を調査しました。ゲノム。 我々は、選択された 10 個の高品質アナモックス ゲノムの中から合計 55 個の Amt を同定しました。 Amtの系統解析により、アナモックス細菌にはRh型とMEP型の両方のAmtが含まれることが示唆された（図6A）。 我々は、AOBおよびニトロスピラNOBとクラスター化するRh型分岐においてアナモックスAmtの1つのクレードを同定し[72]、MEP型分岐において6つのアナモックスAmtクレードを同定した(図6A)。 AOB [73、74] および他の生物 [75] の Rh 型輸送体タンパク質は、アンモニウム親和性が低く、ミリモル範囲の高アンモニウム濃度でのみ機能することが証明されていますが、MEP 型アンモニウム輸送体はより高い親和性を持っています [76] 、77]、アンモニウム濃度が低い条件下では効率的です。 親和性の低い Rh 型 Amt は、Ca ファミリーのゲノムに保存されています。 ブロカディア科と Ca. Bathyanammoxibiaceae ですが、Ca には存在しないようです。 Scalinduaceae (図 6B)。 MEP 型の高親和性 Amt、Ca のアナモックス細菌の場合。 Scalinduaceae 科には 4 ～ 8 個の植物がありますが、Ca. Bathyanammoxibiaceae のメンバーは、これらのアンモニウム輸送体を 2 ～ 5 つだけ持っています (図 6B)。 代替基質や余分なアンモニウムが入手できないことと相まって、Ca にコードされる高親和性アンモニウム トランスポーターが減少します。 CaよりもBathyanammoxibiaceae。 Scalinduaceae は、前者がアンモニウムの高濃度またはフラックスの条件でのみ生息するように仕向けている可能性があり、これは観察された Ca の優先性によって裏付けられています。 Bathyanammoxibiaceae の堆積物層では、アンモニウムの利用可能性が (観察または推定で) 高くなります。

アナモックス細菌およびその他の関連窒素循環グループ (AOB、NOB、および AOA) における Amt の最尤系統樹。 窒素循環グループの amt クレードが異なる色で強調表示されます。 バーは、残基ごとの推定配列相違を示します。 B 選択された 10 個の高品質アナモックス細菌ゲノムにおける Amt の出現を示すヒートマップ。

ゲノムから推測される、Ca に対するアンモニウムの利用可能性が高いことが好ましい。 Bathyanammoxibiaceae は、アナモックス細菌の最近の系統発生学的および分子時計分析とも一致しています [78]。 この研究では、地球上のアナモックス細菌は、大酸化現象 [78] の頃に出現し、それ以前はアンモニウムが主要な海洋窒素種であったと推測されています [1]。 Ca. Bathyanammoxibiaceae は Ca よりも深く分岐しています。 Scalinduaceae は、アナモックス細菌の元の条件 (たとえば、高アンモニウム濃度) によりよく適応した可能性があります。

この研究では、亜硝酸塩の蓄積を特徴とする堆積物 30 地点のうち 2 地点の微生物学的データのみが分析されたこと、そして AMOR 堆積物に関してここで提案されているメカニズムが、より広範な地球上の他の地点にも適用できるかどうかは不明のままであることは注目に値する。 深さまで分解された微生物学的データが、この評価を行うための鍵となります。 28 の文献サイトの一部、特にアタカマ海溝の微生物群集は特徴付けられていますが [10, 79]、これらのアタカマ海溝のコアとここで調査した 2 つの AMOR コアの間には少なくとも 2 つの違いが見られます。 （i）ハダルトレンチ堆積物中のアナモックス細菌の相対存在量の最大値（コミュニティ全体の最大 5%、[10]）は、AMOR コア（コミュニティ全体の最大 15%、図 2）よりもはるかに低い。 (ii) 亜硝酸塩プロファイルの形状が異なります。 両方のAMORコアの上部亜硝酸塩消費ゾーンは酸素ゾーンから十分に分離されていますが（図1B、C）、一部のアタカマ海溝コア（AT1、AT3など）の酸素ゾーンを含む上部では亜硝酸塩が頻繁に検出されました。 、AT4、AT6、およびAT7;図S3）、好気性プロセスがこれらのトレンチコアの浅い堆積物中の亜硝酸塩の生成または枯渇に役割を果たしている可能性があることを示しています。 このような違いは、それぞれが異なる深さ、有機物と栄養素の供給、および堆積速度によって特徴付けられるこれらの異種の場所で予想されます。 海洋堆積物中で観察された亜硝酸塩の蓄積の根底にある微生物のプロセスについてより完全な理解を発展させるには、より多くの堆積物コアの微生物学的調査が必要です。

私たちは生物地球化学、微生物学、ゲノムデータを組み合わせて、アナモックス細菌と海洋堆積物におけるそれらの地球化学的影響を研究しました。 我々は、アナモックス群落が両方の家族Caのメンバーで構成されていることを明らかにしました。 トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae と、北極中央海嶺から採取された 2 つの堆積物コア内でそれらの間を分割するニッチを記録しました。 これらのコアは、硝酸塩欠乏帯の周囲に亜硝酸塩の蓄積を示し、これと類似の特徴は、地球上に分布する他の 28 の海洋堆積物コアや他の層状水生環境でも観察されました。 蓄積された亜硝酸塩は主に硝酸塩還元剤によって生成され、アナモックス細菌と亜硝酸塩還元剤に対するアンモニウムの制限により蓄積します。 AMOR 堆積物コアで観察された亜硝酸塩の蓄積には、2 つのアナモックス細菌ファミリー間のニッチ分配が伴います。 Bathyanammoxibiaceae および Ca. Scalinduaceae は、それぞれ、より高いアンモニア条件とより低いアンモニウム条件を占めます。 このニッチ分割は、アンモニウム同化における能力の違いと、尿素やシアン酸塩などの代替有機窒素基質の利用によって引き起こされる可能性があります。 観察された地球化学的および微生物学的データを説明できると同時に堆積履歴を調整できる機構モデルを開発する今後の取り組みにより、海洋堆積物における窒素循環プロセス間の相互作用の理解が大きく前進するでしょう。

カンディダトゥス・バティアナモキシビウス・アモリス。 Bathyanammoxibius amoris (a.mo'ris、NL gen. masc、AMOR の n. amoris、この細菌が豊富に発見された海洋学的場所 (北極海中央海嶺、AMOR) に由来)。 このゲノムは、以前に報告された Bathyanammoxibius Bin_158 と 98.8% のアミノ酸同一性を示します [16] が、より完全です (72.4% と比較して 96.6%)。 これには、ヒドラジンシンターゼ、ヒドラジンデヒドロゲナーゼ、亜硝酸酸化還元酵素、ヒドロキシルアミン酸化還元酵素など、アナモックス代謝の主要な酵素の必須遺伝子が含まれています。 ゲノム中にウレアーゼまたはシアナーゼ遺伝子は発見されませんでした。 Candidatus Bathyanammoxibius amoris のゲノム参照配列は JAMXCW000000000 です。 このゲノムは、クニポビッチ海嶺中央部 (北緯 76 度 55 分、東経 7 度 7.5 分) のコア GS16-GC05 (海底下 55 cm) から回収されました。 ゲノム内の G + C 含有量は 52.36% です。

この研究では 2 つのコアが同じサンプリングと分析手順で研究されましたが、それらは 2 つの異なる航海中に収集されました。 GS14-GC04（北緯71度17.08分、西経6度33.69分）は、ノルウェーのR/V GO SarsによるCGB 2014夏のクルーズ中に、重力コアラーを使用して水深1050メートルの海底から回収されました。 このコアリングサイトは、ヤンマイエン熱水噴出孔 [71.2°N、5.5°W、[19, 20]] の西約 50 km、ヤンマイエン画分帯の北にあります (図 1A)。 GS16-GC04 は、中央モーンズ尾根 (北緯 72 度 16 分、東経 1 度 42 分) の東側腹から同じ方法を使用して回収されました。 他の場所で説明されているように [13]、回収されたコアはデッキ上で 2 つの半分に分割されました。 半分はすぐにプラスチックフィルムで包まれ、ベルゲン大学のコアリポジトリで 4℃ で保管され、もう半分はデッキでのサンプリングに使用されました。 まず、酸素濃度は、作動半分の選択された深さの中央部分にセンサーを下げて、オプトードを使用して測定されました。 オプトードセンサーは、メーカーのプロトコルに従って校正された MICROX TX3 シングルチャンネル光ファイバー酸素メーターに接続されました (PreSens、Regensberg、Germany)。 次に、Rhizon サンプラー [80] を使用して、離散的な深さから間隙水が抽出されました。 微生物サブサンプルは、間隙水抽出とほぼ同じ深さから滅菌 10 ml カットオフシリンジを使用して、間隙水抽出と同時に採取され、陸上ベースの DNA 分析のために –80 ℃ で即座に凍結されました。

地球化学分析は、[13] に記載されているのと同じ手順を使用して実行されました。 間隙水中の栄養塩濃度は船上で測定されました。 アンモニウム (NH4+)、硝酸塩 (NO3-)、亜硝酸塩 (NO2-)、および溶存無機炭素 (DIC) の濃度は、メーカーのプロトコルに従って、QuAAtro 連続フロー分析装置 (SEAL Analytical Ltd、サウサンプトン、英国) によって比色分析されました。 アンモニウムの測定には、インドフェノール測光法が使用されました [81]。 亜硝酸塩は、N-1-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩およびスルファニルアミドと反応させた後、ピンク色の錯体として測定されました。 間隙水の硝酸塩と亜硝酸塩の合計は、Cu-Cd 還元コイルによって硝酸塩を亜硝酸塩に還元した後、同じ方法を使用して測定されました [82]。 硝酸塩濃度は、これら 2 つの測定値の差として計算されました。 DIC のプロトコルは [83] に基づいています。 金属濃度（溶解した Mn および Fe を含む）の間隙水サンプルは、超純硝酸で最終濃度 3 vol% まで酸性化し、分析まで酸洗浄したボトルに入れて 4 oC で保管しました。 金属濃度は、ベルゲン大学の Thermo Scientific iCap 7600 ICP-AES (誘導結合プラズマ原子発光分析) によって測定されました。 全有機炭素 (TOC) と窒素 (TON) の測定では、沈殿物を最初に 95 ℃で 24 時間乾燥させ、次に 1 mL のリン酸。

堆積物コア内の硝酸塩欠乏ゾーンへの硝酸塩の拡散フラックスと、そこからの亜硝酸塩の流出（上向きと下向きの両方）は、フィックの拡散の第一法則を使用して測定されたプロファイルに基づいて計算されました。

ここで、J は磁束です。 φ は測定された堆積物の空隙率です。 Ds は、R パッケージ marelac [84] を使用して計算された、特定の溶質 (m2 yr−1) の堆積拡散係数です。 z は海底から下の堆積物の深さ (m) です。 ∂[C]/∂z は、近くの 3 つのデータ点から計算された溶質 (NO3- または NO2-) 濃度勾配 (mmol m-4) に等しくなります。 亜硝酸塩と硝酸塩のフラックスの比は、亜硝酸塩の上向きおよび下向きフラックスの合計を硝酸塩の（下向き）フラックスで割ることによって計算されました。 30 の堆積物サイトにおけるこの比の平均値と 95% 信頼区間は R で計算されました。

アンプリコン シークエンシングおよび qPCR 用の全 DNA は、PowerLyze DNA 抽出キット (MO BIO Laboratories, Inc.) を使用してサンプルあたり約 0.5 g の沈降物から抽出されました。ただし、次のわずかな変更が加えられました: (1) 溶解チューブを G2 チューブ (Amplikon、 (2) FastPrep-24 機器 (MP Biomedicals) を使用してビーズを叩解する (速度 6.0、45 秒) 前に、60 ℃で 30 分間水浴しました。 同じ手順に従って、サンプル抽出バッチと並行してブランク抽出 (沈殿物の添加なし) を実行しました。 DNA は 80 µL の分子グレードの再蒸留水 (ddH2O) に溶出され、分析まで –20 °C で保存されました。 16 S rRNA 遺伝子のアンプリコン ライブラリーは、2 ラウンドのアンプリコン戦略 [13] でプライマー ペア 519 F/806 R を使用し、過剰増幅を最小限に抑えるために各サンプルの最初のラウンドで最適な PCR サイクル数を使用して調製されました。 アンプリコン ライブラリーは、Ion Torrent Personal Genome Machine で配列決定されました。

シーケンスリードは、USEARCH パイプライン [85] を使用して品質フィルター処理され、220 bp にトリミングされ、UCHIME を使用してキメラが検出および除去されました。 トリミングされたリードは、UPARSE を使用して >97% のヌクレオチド配列同一性で操作分類単位 (OTU) にクラスター化されました [86]。 抽出ブランク (陰性対照) で検出された OTU のほとんどは、相互汚染によってブランクに混入した可能性のある少数の OTU を除いて、手動で除去されました。 全体として、ネガティブコントロールのリードの >99.9% が削除されました。 サンプルは、堆積物層ごとに 20,000 の読み取りにサブサンプリングされました。 OTU の分類学的分類は、SILVA 138.1 リリースを参照として CREST パッケージ [87] に実装された最低共通祖先アルゴリズムを使用して実行されました。 アナモックス細菌の相対的な存在量は、Ca 家族に属する OTU の合計パーセンテージとして取得されました。 トカゲ科と Ca. Bathyanammoxibiaceae [16]。 個々の anmmox OTU の分布は、R パッケージ ggplot2 [88] を使用して生成されたヒートマップで視覚化されました。

アナモックス細菌の量は、他の場所に記載されている手順[29]に従い、プライマーペア hzoF1/hzoR1 [89]を使用して hzo 遺伝子 (ヒドラジンの N2 への分解に関与するヒドラジンデヒドロゲナーゼをコードする) を標的とすることにより、qPCR を使用して定量されました。 [29]に記載されているプロトコールを使用して、脱窒細菌の存在量を、narG (ペリプラズム硝酸レダクターゼαサブユニットをコードする)、nirS および nirK 遺伝子 (それぞれチトクロム cd1 および Cu 含有亜硝酸レダクターゼをコードする) を標的とすることによって定量化した。 これらの機能遺伝子の qPCR スタンダードは、対応する qPCR プライマーを使用した環境サンプルの DNA 抽出物の PCR 増幅から調製されました。 hzo および narG 遺伝子については、海洋堆積物層 (コア GS14-GC08 [13] 160 cm) の DNA 抽出物が使用され、一方、nirS および nirK 遺伝子については、北極の永久凍土土壌サンプルが使用されました。 精製後、ベクターへのライゲーションと大腸菌 DH5α のコンピテントセルへの形質転換を含め、StrataClone PCR クローニング キット (Agilent Technologies, USA) を使用して PCR 産物をクローニングしました。 形質転換された大腸菌細胞をLB固体培地上にプレーティングし、青/白コロニー選択のために一晩増殖させた。 各遺伝子について、白いコロニーが選択され、ベクター プライマー M13F/M13R を使用して増幅され、リニア qPCR スタンダードが生成されました。 さらに、古細菌および細菌の 16 S rRNA 遺伝子を [90] に記載されているように定量しました。 古細菌および細菌の 16 S rRNA 遺伝子定量用の qPCR 標準は、それぞれ、Thaumarchaeota fosmid 54d9 (AJ627422) および E. coli のゲノム DNA でした。 総細胞存在量は、各細菌または古細菌のゲノムに 16 S rRNA 遺伝子の単一コピーがあると仮定して、16 S rRNA 遺伝子コピーから推定されました [53]。 すべての遺伝子存在量は qPCR で 3 回測定され、標準偏差は水平エラーバーを使用して表示されます。 前述のグループの絶対存在量も、総細胞存在量とアンプリコン配列決定によって評価されたコミュニティ全体におけるこれらのグループの割合の積として計算されました。

Ca の高品質ゲノム (90% 以上の完全性と 5% 未満の冗長性) を回復します。 Bathyanammoxibiaceae では、コア GS16-GC05 の 55 cm の堆積物層に焦点を当てました。これは、以前の調査で、この特定の堆積物層に最も高い Ca が相対的に豊富に存在することが示されていたためです。 全古細菌および細菌群集における Bathyanammoxibiaceae [16]。 メーカーの指示に従い、PowerLyze DNA 抽出キット (MO BIO Laboratories, Inc.) を使用して、6.4 g の沈降物 (12 回の個別の溶解のそれぞれに約 0.4 ～ 0.6 g の沈降物) から全 DNA を抽出します。 さらなる分析のために、DNA 抽出物を 12 個のスピンカラムから 100 µL の ddH2O に繰り返し溶出しました。

ショットガンメタゲノムライブラリーは、NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit (New England Laboratories) を使用して構築し、MIT BioMicro Center の NextSeq 500 シーケンサー (Illumina) で配列決定しました (2 x 150 bp ペアエンド)。 読み取りの品質とアダプター配列の存在は、最初に FastQC v.0.11.9 を使用してチェックされました [91]。 アダプターは削除され、BBMap パッケージに実装されている BBDuk を使用して読み取りがトリミングされました [92]。 処理されたリードの全体的な品質は、FastQC v.0.11.9 [91] を使用した最終チェックで評価され、高品質のリード (つまり、最小長が 50 bp で、Phred 品質スコアが 30 を超える) のみが評価されたことが保証されました。下流の分析で使用されます。 品質管理されたリードは、Megahit v.1.1.2 [93] を使用して、k-mer 長が 27 から 117 まで変化し、コンティグ長の閾値が 1000 bp であるコンティグに de novo アセンブルされました。 コンティグは、MaxBin2 v2.2.6 [94]、MetaBAT v2.15.3 [95]、および CONCOCT v1.1.0 [96] の 3 つのプログラムを使用してゲノム ビンにグループ化され、すべてデフォルトのパラメーターが使用されました。 これら 3 つのプログラムから得られたビンは、デフォルト パラメータを使用した DAS_Tool v1.1.4 [97] による複製解除と集約の対象となりました。 得られたゲノムビンの品質は、CheckM v.1.1.3 [98]のオプション「lineage_wf」を使用して評価されました。 ブロカディア目に属するゲノムの品質を向上させるために、品質管理されたリードは BBmap [92] を使用してコンティグにマッピングされ、マッピングされたリードは SPAdes v.3.14.0 [99] を使用して再組み立てされました。 1000 bp より短いコンティグを削除した後、[13] で説明されているように、gbtools [100] を使用して、結果として得られた足場を視覚化し、手動で再ビニングしました。 得られるCaの品質。 Bathyanammoxibius ゲノムは、プランクトミセテス マーカー遺伝子セットに基づいて、CheckM「lineage_wf」コマンドを使用して再度チェックされました。

Ca ゲノムの比較解析を行いました。 Scalindua sediminis [13] および Ca. Bathyanammoxibius amoris (この研究で発見)、海洋堆積物中の 2 つのアナモックス細菌科の優占種 [16]。 http://merenlab.org/2016/11/08/pangenomics-v2/ で説明されているワークフローに従って、Anvio v7.1 [101] を使用して分析を実行しました。 すべてのゲノムは、最初に Prokka v.1.14 [102] を使用し、参照データベースとしてタンパク質のオルソロガス グループ (COG) クラスター (COG) [103] を使用する BLASTp を使用してアノテーションが付けられました。 比較ゲノム解析では、BLAST を使用して遺伝子の各ペア間の類似性を定量化し、マルコフ クラスター アルゴリズム (MCL) [104] (膨張パラメーター 2 を使用) を使用して相同遺伝子のクラスターを解決します。 2 つのゲノム内の共通遺伝子と固有遺伝子は、機能強化分析によって同定されました [105]。

16 S rRNA 遺伝子に基づく最尤系統樹が、既知のアナモックス細菌および NCBI データベースの BLASTn [106] によって同定された推定上のアナモックス OTU の近縁種について再構築されました。 配列は MAFFT-LINSi [107] を使用してアラインメントされ、最尤系統樹は IQ-TREE v.1.5.5 [108] を使用して、ModelFinder [109] によって選択された最適な置換モデルとして GTR + F + R5 を使用して推論されました。 。 ツリー トポロジの堅牢性を評価するために、UFBoot2 [110] を使用して 1000 回の超高速ブートストラップ反復が実行されました。

Amt (アンモニウム輸送体) の系統発生については、anammox ゲノムの配列が Prokka アノテーションから抽出され、NCBI データベースに対する BLASTp [106] 検索のクエリとして使用され (>50% の類似性が保持されました)、その近縁種を特定しました。 。 これらの配列は、既知の硝化菌 (例: ニトロソスピラ属、ニトロソモナス属、ニトロソスコッカス属のアンモニア酸化細菌 (AOB)、ニトロスピラ属およびニトロスピナ属の亜硝酸酸化細菌 (NOB)、およびタウマルチャエオタ門のアンモニア酸化古細菌 (AOA) で補完されました。 )、MAFF-LINSi を使用して位置合わせを行いました [107]。 アライメントは、trimAl [111] を「自動」モードで使用してトリミングされました。 最尤系統樹は、IQ-TREE v.1.5.5 [108] を使用し、最適置換モデルとして LG + F + R7 と 1,000 の超高速ブートストラップを使用して再構築されました。

この研究で使用されたすべての配列データは、プロジェクト番号 PRJNA854201 で NCBI Short Reads Archive で入手できます。 コア GS16-GC05 (55 cm) の生のメタゲノム配列データは、BioSample 番号 SUB11625283 で NCBI データベースから入手できます。 Caのゲノム。 Bathyanammoxibius amoris は、アクセッション番号 JAMXCW000000000 で入手できます。 コア GS14-GC04 の生の地球化学データは補足データ S1 にあります。 図S3に示す28の参照サイトの硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウムの間隙水プロファイルの編集は、補足データS2にあります。

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AMOR 地域での堆積物コア採取の機会は、主任科学者のロルフ・ビルガー・ペダーセン氏と R/V GO Sars の乗組員によって可能になりました。 アンプリコンの調製については Anita-Elin Fedøy、サンプリング収集と DNA 抽出については Michael Melcher と Steffen Lydvo、堆積物の炭素と窒素の含有量の測定については Jan-Kristoffer Landro に感謝します。 匿名の査読者からの建設的なコメントにより、この記事の品質は大幅に向上しました。 この研究活動は、ノルウェー研究評議会から地質生物学センター、KGジェブセン財団およびトロンド・モーンズ科学財団からSLJへの資金提供を受け、またシモンズ財団助成金622065および国立科学財団助成金OCE-2138890およびOCE-2142998からARBへ資金提供されました。 。 RZ は MIT モリーナ博士研究員フェローシップによってサポートされています。

マサチューセッツ工科大学地球大気惑星科学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02139、米国

ルイ・ジャオ & アンドリュー・R・バビン

ベルゲン大学地球科学部深海研究センター、ベルゲン、5007、ノルウェー

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RZ と SLJ がこの研究を考案しました。 RZ、DR、IHT、SLJ はクルーズ船上でサンプルを収集しました。 DR と IHT は間隙水の抽出と分析を実施しました。 RZ、SLJ、ARB はゲノムデータを収集し、分析しました。 RZ は DNA 分析を実行し、結果を解釈しました。 RZ と ARB が原稿を執筆し、著者全員が編集して承認しました。

Rui Zhao、Andrew R. Babbin、または Stephen L. Jørgensen との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Zhao、R.、Babbin、AR、Roerdink、DL 他北極海中央海嶺堆積物における亜硝酸塩の蓄積とアナモックス細菌のニッチ分配。 共通のイズム。 3、26 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s43705-023-00230-y

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受信日: 2023 年 2 月 21 日

改訂日: 2023 年 2 月 27 日

受理日: 2023 年 3 月 13 日

公開日: 2023 年 3 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00230-y

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